2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of the forensic methylation panel to estimate the physical stress, age and body fluid type
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17K09281
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
橋谷田 真樹 関西医科大学, 医学部, 准教授 (40374938)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | メチル化解析 / 年齢推定 / ストレス定量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
29年度はDNAのメチル化を指標とした年齢推定の検証実験を行った．ターゲット遺伝子は，これまでにメチル化率と年齢の相関がみられるとの報告されている，C1orf132, CCDC102B, ELOVL2, FHL２, SLC6A4, TRIM59の６遺伝子である．剖検で得られた0歳から86歳までの計46例から採取された血液を試料とした．その詳しい内訳は，0～40歳までが11例，40歳代～80歳代までの各年代から7例ずつである．まず，DNAのバイサルファイト処理を行い，処理後のゲノムの目的遺伝子領域をPCRで増幅した．精製後，ライブラリの構築および，テンプレートの調整を行った．シークエンスランはIon 318 Chipを用い，Ion PGM Systemにて行った．CpGサイトの解析は，Plug-inとしてMethylationAnalysis_Ampliconを用いて,付属のIon Torrent Suite softwareにて行った．得られたメチル化情報から各遺伝子におけるメチル化率を算出し，それと年齢情報をXLSTATソフトウェアにより重回帰分析を行った．
分析の結果，各遺伝子内に存在するCpGサイトのメチル化率は0.072～0.890を示し，遺伝子としてのメチル化率は0.374(FHL2)～0.553(C1orf132)の範囲であった．重回帰分析の結果，FHL2，SLC6A4, TRIM59の３遺伝子は年齢との相関が乏しいため除き，C1orf132, CCDC102B, ELOVL2の３遺伝子のメチル化率を用いたところR2は0.793となった．これらからメチル化率と年齢の推定式，
推定年齢＝54.3-52.46×(C1orf132)-34.8×(CCDC102B)+91.7(ELOVL2)
が導き出された．また，実年齢と推定年齢の誤差は，-28歳から＋20歳を示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初，29年度はラットを用いた動物実験を行い，身体的なストレスが及ぼすメチル化の変化を観察する予定であった．この場合，ターゲットとなる遺伝子，およびメチル化座位が不明なため，我々が所持している次世代シークエンサー（Ion PGM System）より高出力な機器が必要である．その点は実験計画立案の時点で判明しており，外注するか他の施設の機器を拝借する予定であった．しかしながら，その調整に思った以上に時間を要したことから，30年度に実行予定であった，メチル化を利用したDNAによる年齢推定を先に行うこととした．その成果は29年度の研究実績に記した通りであり，実験順番が単に逆になっただけであり，計画内容としては順調に進展していると言える．
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAメチル化を指標とした年齢推定の精度を上げるために，新たに５つの遺伝子，KLF14, F5, ASPA, CCDC102B, PDE4CのCpGサイトを対象として解析を行うこととする．また，動物実験によるメチル化を指標としたストレスマーカーの探索も年齢推定の実証実験に引き続き行う．我々が所持している次世代シークエンサーよりもより高出力なものが必要となるため，メーカーに外注とするか，他施設のものを使用させてもらうかは今後の検討課題ではある．しかしながら，動物実験を行い，試料を採取しておくことは可能であることから，試料からゲノムDNAを抽出し，バイサルファイト処理を行い，メチル化されているシトシンはそのままに，されていないシトシンをチミンに変換させるところまでは実験を進めておく．
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| Causes of Carryover |
29年度は動物実験を行う予定であったが，解析機器使用に関しての調整が必要であったため，メチル化を指標とした年齢推定を先に行った．こちらはあらかじめ報告のあった遺伝子座位をターゲットとしているため，使用した費用はほとんど次世代シークエンサーの試薬代である．そのため29年度は予想以上に使用額が少なく済んだのが次年度使用額が生じた理由である．一方，30年度は動物実験をメインに行う予定であるが，これには我々が所持している以上の高性能の次世代シークエンサーを必要とするため，高額な実験費用を要すると思われる．しかしながら，解析には外注，もしくは他施設の拝借等を考えながら予算の範囲内で行う予定である．
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