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2018 Fiscal Year Research-status Report

Analysis of pharmacological actions of Ephedra Herb through stimulation of endocytosis

Research Project

Project/Area Number 17K09321
Research InstitutionKitasato University

Principal Investigator

日向 須美子  北里大学, 東洋医学総合研究所, 研究員 (60353471)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords麻黄 / c-Met / クラスリン依存性エンドサイトーシス / トランスサイトーシス
Outline of Annual Research Achievements

これまでに、麻黄エキス(EHE)は、肝細胞増殖因子受容体c-Metを過剰発現しているヒト非小細胞肺がんH1993細胞のc-Met発現をダウンレギュレーションすることを見出した。昨年度の研究から、EHEはクラスリン依存性エンドサイトーシスに影響を与えていることが示唆された。そこで、クラスリンの重合を阻害するクラスリン阻害剤Pitstop2を用いて、EHEによるc-Metのダウンレギュレーションが阻害されるかどうかを検討した結果、Pitstop2濃度依存的に阻害された。一方、カベオラを壊してカベオリン依存性エンドサイトーシスを阻害するMethyl-β-cyclodextrinは、EHEの作用に影響を与えなかった。これらの結果から、EHEはクラスリン依存性エンドサイトーシスを促進していることが示唆された。さらに、リソソームのタンパク質分解酵素阻害Bafilomycin A1の濃度依存的にEHEの作用が阻害されたことから、EHEは、c-Metのクラスリン依存性エンドサイトーシスとリソソームでの分解を促進していることが示唆された。
次に、EHEがトランスサイトーシスを促進する可能性について検討するため、ヒト腸上皮細胞株CACO-2細胞の単層培養を用いたトランスサイトーシスのアッセイ系を構築した。理研細胞バンクからCACO-2細胞を入手し、トランスウエルインサート上で21日間培養し、経上皮電気抵抗(TER)をミリセルERS-2で測定して、200Ω以上になっていることを確認した。トランスサイトーシスのマーカーとして用いられているHRP (horseradish peroxidase)をCaco-2単層培養上に添加し、2時間培養した。下部ウエルに移行したHRP量を酵素活性測定法で定量した結果、4.3%のHRPが下部ウエルに移行し、本アッセイ系が機能していることが明らかになった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定どおり、EHEのエンドサイトーシスのメカニズムを明らかにし、さらに、トランスサイトーシスのアッセイ系を構築できた。
さらに、今年度の研究中に、EHEと既存の受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の作用が大きく異なることを見出した。既存のチロシンキナーゼ阻害剤は、受容体のリン酸化を阻害するが、受容体の発現量は増加した。受容体のダウンレギュレーションは、リン酸化がきっかけとなって起こるが、阻害剤によりリン酸化を阻害されたため、ダウンレギュレーションが止まったと考えられた。一方、EHEは受容体のリン酸化阻害と受容体のダウンレギュレーションを促進したことから、EHEはリン酸化されていない受容体もダウンレギュレーションしていることが示唆され、既存のチロシンキナーゼ阻害剤とは、作用メカニズムが異なることが明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

今年度に作製したトランスサイトーシスのアッセイ系を用いて、EHEがHRPのトランスサイトーシスを促進するかどうかを検証する。また、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス(EFE)についても同様の作用があるのかどうかを確認する。さらに、最近、EHEやEFEの活性成分として、高分子縮合型タンニン(MW 45kDa以上)を見出しており、この高分子成分が下部ウエルにトランスサイトーシスされるのかどうかを検証する。

Causes of Carryover

CACO-2細胞の維持に20%FCS含有培地が必要で、血清の消費量が早く、新しいロットの血清を購入予定であるが、血清のロットチェックが年度内に間に合わず、来年度にロットチェックを行い、血清を購入することとなったため、血清購入費用を次年度に繰り越した。

  • Research Products

    (15 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 1 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (3 results) (of which Overseas: 2 results)

  • [Journal Article] Two flavone C-glycosides as quality control markers for the manufacturing process of ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract (EFE) as a crude drug preparation2018

    • Author(s)
      Oshima Naohiro、Maruyama Takuro、Yamashita Tadatoshi、Uchiyama Nahoko、Amakura Yoshiaki、Hyuga Sumiko、Hyuga Masashi、Nakamori Shunsuke、Takemoto Hiroaki、Kobayashi Yoshinori、Hakamatsuka Takashi、Odaguchi Hiroshi、Hanawa Toshihiko、Goda Yukihiro
    • Journal Title

      Journal of Natural Medicines

      Volume: 72 Pages: 73~79

    • DOI

      10.1007/s11418-017-1111-8

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ephedrine Alkaloids-Free Ephedra Herb Extract, EFE, Has No Adverse Effects Such as Excitation, Insomnia, and Arrhythmias2018

    • Author(s)
      Takemoto Hiroaki、Takahashi Jun、Hyuga Sumiko、Odaguchi Hiroshi、Uchiyama Nahoko、Maruyama Takuro、Yamashita Tadatoshi、Hyuga Masashi、Oshima Naohiro、Amakura Yoshiaki、Hakamatsuka Takashi、Goda Yukihiro、Hanawa Toshihiko、Kobayashi Yoshinori
    • Journal Title

      Biological and Pharmaceutical Bulletin

      Volume: 41 Pages: 247~253

    • DOI

      https://doi.org/10.1248/bpb.b17-00803

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 副作用の少ない、麻黄及び麻黄湯のがん薬物療法の最前線2018

    • Author(s)
      日向須美子
    • Journal Title

      薬局

      Volume: 70 Pages: 278-285

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A Double-Blind, Randomized, Crossover Comparative Study for Evaluating the Clinical Safety of Ephedrine Alkaloids-Free Ephedra Herb Extract (EFE)2018

    • Author(s)
      Odaguchi Hiroshi、Sekine Mariko、Hyuga Sumiko、Hanawa Toshihiko、Hoshi Keika、Sasaki Yoshinobu、Aso Masako、Yang Jinwei、Hyuga Masashi、Kobayashi Yoshinori、Hakamatsuka Takashi、Goda Yukihiro、Kumagai Yuji
    • Journal Title

      Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine

      Volume: 2018 Pages: 1~8

    • DOI

      https://doi.org/10.1155/2018/4625358

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス (EFE) によるCFA誘発関節炎モデルマウスの機械刺激に対する感受性の低下2019

    • Author(s)
      宮嶋直紀, 中森俊輔, 日向須美子, 南可恵, 楊金緯, 内山奈穂子, 日向昌司, 大嶋直浩, 天倉吉章, 袴塚高志, 合田幸広, 小田口浩, 花輪壽彦, 小林義典
    • Organizer
      日本薬学会第139年会
  • [Presentation] 麻黄に含まれるエフェドリンアルカロイドの自発運動能に対する作用の解析2019

    • Author(s)
      黄雪丹, 安藤真紀, 尾野颯哉, 張葉琳, 日向須美子, 竹元裕明, 山下忠俊, 楊金緯, 内山奈穂子, 日向昌司, 大嶋直浩, 天倉吉章, 袴塚高志, 合田幸広, 小田口浩, 花輪壽彦, 小林義典
    • Organizer
      日本薬学会第139年会
  • [Presentation] 今後臨床応用を目指すエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス(EFE)の臨床的安全性2018

    • Author(s)
      小田口浩, 関根麻理子, 日向須美子, 楊金緯, 日向昌司, 小林義典, 袴塚高志, 熊谷雄治, 花輪壽彦
    • Organizer
      第69回日本東洋医学会学術総会
  • [Presentation] c-Met阻害作用を有する麻黄エキスとc-Met阻害剤SU11274の作用様式の比較2018

    • Author(s)
      日向須美子、日向昌司、袴塚高志、合田幸広、小田口 浩、花輪壽彦
    • Organizer
      第35回和漢医薬学会学術総会
  • [Presentation] 麻黄の産地の違いを反映する非アルカロイド(2)2018

    • Author(s)
      大嶋直浩,山下忠俊,日向須美子,天倉吉章,日向昌司,中森俊輔,内山奈穂子,楊金緯,伊東秀之,小林義典,袴塚高志,小田口浩,合田幸広
    • Organizer
      日本生薬学会第65回年
  • [Presentation] 副作用成分を除去した安全性の高いエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス(EFE)2018

    • Author(s)
      日向須美子, 中森俊輔, 竹元裕明, 日向昌司, 小林義典, 袴塚高志, 合田幸広, 小田口浩, 花輪壽彦
    • Organizer
      NPO法人 セルフメディケーション推進協議会 学術フォーラム
  • [Presentation] 特別講演I「麻黄湯と麻黄の抗がん・抗転移作用の発見から安全性の高いエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス(EFE)の開発へ」2018

    • Author(s)
      日向須美子
    • Organizer
      第28回日本東洋医学会関東甲信越支部神奈川県部会学術大会 第50回神奈川県東洋医会
    • Invited
  • [Remarks] 北里大学東洋医学総合研究所 研究部門 臨床研究部

    • URL

      https://www.kitasato-u.ac.jp/toui-ken/research/rin_research.html

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 麻黄エキス、又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスより得られた 高分子縮合型タンニンを含有する抽出分画物とその製法及び用途2019

    • Inventor(s)
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Holder
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2019-0012222
    • Overseas
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 麻黄エキス、又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスより得られた 高分子縮合型タンニンを含有する抽出分画物とその製法及び用途2019

    • Inventor(s)
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Holder
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      201910085061.5
    • Overseas
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 麻黄エキス、又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスより得られた 高分子縮合型タンニンを含有する抽出分画物とその製法及び用途2018

    • Inventor(s)
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Holder
      花輪壽彦、日向須美子ら
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2018-237151

URL: 

Published: 2019-12-27  

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