ビタミンAを介した腸管マクロファージ・オートファジー調節機序

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09366
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 平賀 寛人 弘前大学, 医学研究科, 助教 (80637546)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ビタミンA / マクロファージ / インフラマソーム

Outline of Annual Research Achievements

当該年度に実施した研究の成果は下記の通りである。
(1)CD患者における血清中ビタミンA濃度・血清中及び腸管局所のIL-1beta発現の測定。
当科外来・入院で加療中のCD患者（活動期：30人、寛解期：30人、計：60人、うちエレンタール投与中30人（1日3パック以上15人、未満15人））、治療介入前の新規発症CD患者から採血を施行し、血清中ビタミンA濃度をBML社に外注・委託して測定した。血清中ビタミンAはCRPと有意な相関関係を認め、活動性指標として有用と考えられた。
(2)VAD・DSS誘発腸炎マウスの粘膜下組織におけるオートファジー関連分子（LC3-II・p62等）の動態をWestern blot法でタンパク発現量を解析し、オートファジー活性化の程度を評価した。VADマウスの粘膜下組織ではLC3-IIの発現が亢進、p62は変化を認めなかった。
(3)VADマウスCD11b+脾細胞を用いて、LPS刺激時のNLRP3インフラマソームの動態を解析した。VADマウスからCD11b+脾細胞を分離、LPS刺激下で培養、上清（24時間後）中のサイトカイン（IL-1 beta、IL-18）を測定したところ、VAD群でいずれも産生亢進していた。
(4)RAR阻害剤で処理したマクロファージ細胞株を用いて、LPS刺激時のNLRP3インフラマソーム・オートファジー関連分子の動態を解析した。マクロファージ細胞株であるRAW264.7（マウス）・THP-1（ヒト）をRAR阻害剤（Ro41）で処理した後、対照群・LPS添加群（10 g/ml）に分けて培養した。RAR阻害剤処理群では上清中のIL-1 beta・IL-18産生量は亢進していた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

培養細胞のsiRNAの系が当初の予定よりは進展が遅れているが、その他計画通りである。

Strategy for Future Research Activity

本年度の計画は下記の通りである。
(1)VAD GFP-LC3IIトランスジェニックマウスを用いてDSS誘発腸炎マウスを作製し、ビタミンA欠乏状態におけるオートファゴソーム発現量・形態の変化を解析する。
①GFP-LC3IIトランスジェニック（Tg）マウスでVADマウスを作製、DSS腸炎誘発
GFP-LC3II融合遺伝子を導入、GFP励起により全身のオートファゴソームが緑色蛍光を発するマウス（GFP-LC3#53 (BRC No. RBRC00806 / RIKEN BRC）を用いて解析する。
②蛍光顕微鏡を用いてVAD GFP-LC3II Tgマウスのオートファゴソームの発現量を解析する。
DSS腸炎誘発から0・1・2日後、ホルムアルデヒド環流法で組織を固定してからマウスをsacrifice、大腸の各部位（口側、中央、肛門側）をOCT compoundに包埋・液体窒素で凍結保存する。凍結標本をコールドトームで薄切・蛍光顕微鏡下でGFP励起されたオートファゴソームを観察する。