ビタミンAを介した腸管マクロファージ・オートファジー調節機序

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09366
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 平賀 寛人 弘前大学, 医学研究科, 助教 (80637546)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ビタミンA / マクロファージ / インフラマソーム

Outline of Annual Research Achievements

(1)VAD GFP-LC3IIトランスジェニックマウスを用いてDSS誘発腸炎マウスを作製し、ビタミンA欠乏状態におけるオートファゴソーム発現量・形態の変化を解析
①GFP-LC3IIトランスジェニック（Tg）マウスでVADマウスを作製、DSS腸炎誘発
GFP-LC3II融合遺伝子を導入、GFP励起により全身のオートファゴソームが緑色蛍光を発するマウス（GFP-LC3#53 (BRC No. RBRC00806 / RIKEN BRC）を用いて解析した。
②蛍光顕微鏡を用いてVAD GFP-LC3II Tgマウスのオートファゴソームの発現量を解析した。DSS腸炎誘発から0・1・2日後、ホルムアルデヒド環流法で組織を固定してからマウスをsacrifice、大腸の各部位（口側、中央、肛門側）をOCT compoundに包埋・液体窒素で凍結保存。凍結標本をコールドトームで薄切・蛍光顕微鏡下でGFP励起されたオートファゴソームを観察した。
(2)VAD GFP-LC3II TgマウスCD11b+脾細胞の不良ミトコンドリア蓄積を測定
前述の方法でVAS・VAD GFP-LC3II Tgマウスから脾細胞を分離、MitoSOX・Mitotrackerを用いて、細胞内に蓄積した不良ミトコンドリアを測定することで、オートファジー機能を定量・評価した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CD11b+脾細胞の不良ミトコンドリア蓄積の測定が遅れているが、その他計画通りである。

Strategy for Future Research Activity

平成31年度の計画は下記の通りである。
(1)抗IL-1b抗体またはエレンタールによるオートファジー機能のreverse効果を確認する。
①抗IL-1b抗体・エレンタール前投与：抗IL-1b抗体(BioLegend社)を注射用水で溶解する。VAD・VASマウスを対照群と抗体投与群に分け、実験当日から計5日間、対照群には溶媒のみ、抗体投与群には50 μg/0.1 mlを腹腔内投与する。エレンタール前投与に関しては、対照群には通常通りビタミンA欠乏食を継続、前投与群には2週間前からエレンタール粉末を自由摂食させて用いる。②DSS誘発腸炎：生存率・体重曲線でreverse効果を判定する。誘発0・1・2日後に粘膜下組織のタンパクを抽出、NLRP3インフラマソーム・オートファジー関連分子を解析する。③Salmonella typhimurium経口感染：S.typhimurium Χ3306株を1X108 CFU/0.2 mlに調整し、経口感染させる。生存率・感染24時間後の臓器内菌数でreverse効果を確認する。④Listeria monocytogenes経静脈感染：Listeria monocytogenes 1b 1684株を5X105 CFU/0.2 mlに調整し、経静脈感染させる。生存率・感染24時間後の臓器内菌数でreverse効果を確認する。⑤GFP-LC3II Tgマウスを用いたreverse効果の解析：DSS誘発腸炎マウスの大腸におけるオートファゴソーム発現・形態を対照群と治療群で比較検討し、reverse効果を証明する。
(2)CD患者における血清中ビタミンA濃度の測定（炎症の活動性・エレンタール投与の有無）。
前年度に採血した新規発症CD患者から治療介入後の採血を施行し、血清中ビタミンA濃度・IL-1bをBML社に外注・委託して測定、疾患活動性・エレンタール投与量との関連を解析する。