シクロスポリンによるFLIPを介した腸上皮細胞ネクロプトーシス抑制効果

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09367
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 櫻庭 裕丈 弘前大学, 医学研究科, 講師 (90422063)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ネクロプトーシス / HMGB-1 / シクロスポリン / 腸上皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

初年度は、マウス(C57BL/6)に４％DSSを自由飲水させた急性腸炎モデルにおいてシクロスポリン投与による、ネクロプトーシス調節分子の発現の変化について経時的な解析を行った。これまでの解析の再確認として、シクロスポリンにより、TUNEL陽性腸上皮細胞アポトーシスの経時的な増加がコントロール群に比べて有意に抑制された。また腸上皮アポトーシスに先行して分離した上皮細胞におけるcaspase-8の活性もシクロスポリン投与により有意に抑制された。次にDSS投与０，１、２日目の分離した腸上皮から蛋白抽出を行いのネクロプトーシス調節分子RIPK3, AMPKの発現をウェスタンブロットで解析した。DSS投与０、１，２日目いづれにおいてもコントロール群とシクロスポリン投与群との間に有意な発現の差は認めなかった。一方、ネクロプトーシスからの炎症誘導メディエーターであるHMGB-1の発現は、分離した腸上皮細胞分画においては、DSS投与０，１日目でコントロールに比べてシクロスポリン投与群で有意に抑制されていた。粘膜下組織の分画では、DSS投与2日目において、コントロールに比べてシクロスポリン投与群で有意に抑制されていた。したがって、本年度中に解析したネクロプトーシス調節因子であるRIPK3, AMPKを介さない、HMGB-1の発現抑制効果の存在が示唆された。RIPK3, AMPK以外のネクロプトーシス調節因子であるMLKLやRIPK1などを介したHMGB-1の発現抑制効果、またはネクロプトーシス調節因子そのものを介さずに炎症誘導物質の産生を抑制する可能性が考えられる結果が得られた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

シクロスポリンによるネクロプトーシス関連分子の発現調節について最も想定していたRIPK3の発現に変化がなかったため、その再現性の確認を行ったことや他の因子の解析追加検討が必要となり、炎症誘導物質の産生抑制効果を検討するためのマクロファージ刺激のアッセイができなかった。RIPK3については免疫染色での解析も行ったが、染色性に問題があり評価困難であったため現在抗体試薬を変更し再検討中である。

Strategy for Future Research Activity

DSS誘発大腸炎において、ネクロプトーシスからの炎症誘導メディエーターであるHMGB-1の発現は、粘膜下組織の分画でコントロールに比べてシクロスポリン投与群で有意に抑制されていた。その機序について、まずは腸上皮細胞ネクロプトーシス抑制を介した経路についてRIPK3, AMPKを介さない、HMGB-1の発現抑制効果、つまりMLKLあるいはRIPK1の発現調節を介した効果の有無について検証していく。その2つの因子においても発現に差がみられなかった際は、ネクロプトーシス以外の経路を介したHMGB1の発現調節効果をみていく。私たちのこれまでのほかの研究テーマでの解析において、シクロスポリンの腸上皮細胞障害抑制効果は、多剤併用抗菌薬投与で腸内細菌叢に変化を起こすと、消失することがわかっている。そのときのHMGB-1の発現について解析し、腸内細菌叢と治療効果の関連についても追加解析する方針である。腸内細菌叢からの自然免疫シグナルの変化がネクロプトーシス制御に与える影響についても検証する。

Causes of Carryover

ネクロプトーシス関連分子の発現調節について最も想定していたRIPK3の発現に変化がなかったため、次に行う予定であった炎症誘導物質の産生抑制効果を検討するためのin vitroの解析であるマクロファージ刺激のアッセイが年度内にできず、次年度に行うことになったため。