The target to treat for ER stress in patients with IBD

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09378
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 今枝 広丞 滋賀医科大学, 医学部, 非常勤講師 (20623317)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 小胞体ストレス / TNF-α

Outline of Annual Research Achievements

(1)　炎症性腸疾患大腸粘膜における短鎖脂肪酸受容体の発現を検討する。
プロバイオティクスによる腸内環境安定の作用機序を解明するため、ヒト大腸粘膜における短鎖脂肪酸受容体の発現細胞を検討する。消化管に発現している短鎖脂肪酸受容体としてGPR41 (FFA3), GPR43 (FFA2), GPR109a (PUMA-G), GPR120 (FFA4)がある。免疫組織化学とqPCRにより健常者と大腸クローン病、潰瘍性大腸炎の患者から大腸内視鏡にて採取した生検検体を用いて、それぞれの短鎖脂肪酸受容体がどの細胞に発現していて、健常者と炎症性腸疾患患者とで差があるのかを検討した。
結果、有意にそれぞれの発言が低下していた。
(2)　 炎症性腸疾患大腸粘膜における小胞体ストレスシグナルの発現を検討した。短鎖脂肪酸受容体の発現が小胞体ストレスと関連していることを証明するため、活性型(Spliced) Xbp1, 非活性型(Unspliced) Xbp1, PERK, CHOP, IRE1a, ATF6, ATF4の発現をmRNA、タンパクレベルで確認し、それぞれが短鎖脂肪酸受容体の発現と相関していた。
(3)　in vitroでの短鎖脂肪酸受容体の発現を検討し、小胞体ストレスシグナルとの相関を検討した。ThapsigarginとTunicamycinで細胞を刺激し、GPR41, GPR43, GPR109aの発現をmRNAおよびタンパクレベルで検討する。GSK3β阻害剤BIOとIRE1α endonuclease阻害剤STF-083010、Ern1で小胞体ストレスシグナルを阻害し、GPR41, GPR43, GPR109aの発現が抑制されるのか、qPCRとウェスタン・ブロッティングを用いてmRNA、タンパクレベルで検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト大腸上皮培養細胞における小胞体ストレス誘導による短鎖脂肪酸受容体の発現が、TNF-αで抑制されることを検討する予定である。
小胞体ストレスシグナルによる短鎖脂肪酸受容体発現誘導が、TNF-α濃度依存的および時間依存的に抑制され、Erk1/2, p38, JNK, Aktのリン酸化阻害剤やBAY 11-7085, IκBα siRNAのNF-κB抑制でその抑制が解除されることを検討する。
また短鎖脂肪酸受容体発現誘導がTNF-α濃度依存的および時間依存的に抑制される機序として、PUMA, Bax, Bad, Bid, p53の発現をmRNAおよびタンパクレベルで検討する。この現象が、p53が正常でないHT-29細胞では再現できないことを確認する。
これら細胞株の樹立に時間がかかっているため。

Strategy for Future Research Activity

DSS誘導腸炎マウスにおいて、抗TNF-α抗体が小胞体ストレスシグナルを軽減し、短鎖脂肪酸受容体の発現誘導となることを検討する。
我々の予備実験では、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発腸炎モデルマウスでGPR43の発現がmRNAレベルで有意に亢進していたが、少数での検討であったため、nを増やして検討する。GPR41, GPR43, GPR109a, Xbp1, CHOP, IRE1a, ATF4, ATF6の発現も同様に検討し、TNF-αのqPCR値との相関について検討する。さらに平成29年の実験(3)で検討を行ったPUMA, Bax, Bad, Bid, p53の発現をこのマウス腸炎モデルで調査し、GPR41, GPR43, GPR109aの発現との相関を検討する。

Causes of Carryover

実験計画の遂行のため、計画的な脂溶計画となった。