分子標的治療におけるバイオマーカーとしてのインスリン様増殖因子活性化機構

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09380
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 瀬戸山 健 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (80760595)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 大腸癌肝転移 / 分子標的薬 / 増殖因子 / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

大腸癌肝転移巣局所の微小環境を生理的に再現するため、マウス大腸癌細胞株であるcolon 26とCT26を大腸癌肝転移モデルマウス作成に採用した。まず、逆転写PCR法にて、in vitroで細胞株におけるIGF type 1 receptor（IGF-1R）の発現を確認し、リガンドであるIGFの分泌がないことを確認した。IGFBP分解酵素であるMMP-7の発現もみられず、レンチウイルストランスフェクション法により、これらの細胞株を親株として、MMP-7高発現株を作成した。ウエスタンブロット法により細胞培養液上清にMMP-7が分泌、IGFBP-3が切断され、bioactive formであるFree IGF-1の遊離とIGF-1Rのリン酸化をin vitroで確認した。hemispleen injection法により癌細胞株を野生型マウスに移植した大腸癌肝転移モデルを作成し、免疫染色法を用いて、転移巣におけるMMP-7、IGF-1Rの発現とそのリン酸化を確認した。バイオアッセイであるKIRA法用いて、癌細胞移植から7日目に最も血清bioactive IGFが高値となり、その後、14日目には非担癌個体とほぼ同等まで濃度が低下することが示された。この傾向は、ELISA法による血清Free IGF-1の測定でも確認された。このモデルでは、肝転移の増大速度が速いため、癌細胞の肝生着から転移巣形成早期にIGF signalが活性化している可能性が示唆された。そのため、肝転移形成を抑制する目的に、bioactive IGFを選択的に中和するIGF中和抗体を、癌細胞移植後早期に投与する治療プロトコールを立案した。結果、癌細胞移植早期に中和抗体を投与することで、移植後7日目にみられた血清Free IGFのピークが消失し、局所でIGF signalが抑制されていることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでのin vitro、in vivoの検討から、モデルマウスを用いた治療実験ならびに、バイオマーカー検証の手技とプロトコールはほぼ確立されている。 hemispleen injection法を用いることで、ほぼ100％の肝転移形成率が得られ、検討に必要な個体数を確保することは十分に可能な状態となっている。腫瘍の大きさはルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼアッセイで半定量的に評価した。現在まで実験に使用したマウス大腸癌株であるcolon26とCT26によるモデルでは、MMP-7高発現株は親株に比して肝転移巣が増大し、弱いながらIGF中和抗体による癌転移抑制効果もみられたが、個体数を増やしても個体間のばらつきが大きく、明確な差として検出することが困難であった。そのため、予定されて いた治療実験のデータ集積において少し遅れが生じている。問題点の一つは、hemispleen injection法による肝転移作成モデルは、転移生着率がほぼ100%の安定した方法である一方で、短期間に肝転移の増大がみられ、IGF中和抗体の効果がもっとも発揮されると考えられる転移形成初期をターゲットとするモデルとしては適しておらず、治療による癌転移抑制効果がみえにくい可能性が考えられた。事実、in vitroの検討においてもIGF刺激によるマウス癌細胞株のリン酸化IGF-1Rのシグナルがウエスタンブロット法で非常に弱くしか同定しえず、またin vivoの検討でも、肝転移巣の免役染色上、リン酸化IGF-1Rの染色もまばらである。これらの結果を総合的に考えると、CT26/colon26細胞株自体がもともとIGF signalに対する依存度が低い可能性があり、現在の癌細胞株ならびに治療プロトコールの変更、調整が必要と考えられた。

Strategy for Future Research Activity

実験計画に沿って進めてきた実験内容については概ね順調であり、今後もマウスモデルを用いた治療実験ならびに、バイオマーカー検証を進める予定としている。 ただし、上述した本研究課題の遅れに対する解決策として、これまでの既報を参考にして、IGF signalへの依存度が比較的高いと考えられるマウス大腸癌細胞株であるMC38を用いることを検討している。さらにルシフェラーゼアッセイは個体差が大きく、再現性にも問題があるため、腫瘍量の評価により定量性を持たすために、ヒトCEA導入MC38株（MC38-CEA）を用いる予定である。MC38-CEAはすでに当研究室で所有しており、Cell lysateを用いた逆転写PCR法にて同細胞株のプロファイルを確認したところ、MMP-7の発現がないことが確認されたため、今後レンチウイルストランスフィクション法にてMMP-7高発現株を作成する予定である。MMP-7高発現細胞株が樹立できれば、改めて血清bioactive IGFをKIRA法ならびにELISA法で測定し、IGF signalの活性化を確認する。その上で大腸癌肝転移マウスモデルを作成して、IGF中和抗体による治療実験を行う予定である。その際、肝転移形成初期に的確に治療介入を可能とするために移植する癌細胞数を調整して、安定した肝転移形成モデルが得られる移植細胞数を確認する。 さらに、血清Free IGF測定のタイミングを調整することで、肝転移形成期をより的確にとらえ、転移形成初期～早期に治療介入できるプロトコールを立案する。in vivoにおける治療実験のプロトコールを確定したのち、実験個体数を増やして、MMP-7高発現株と親株におけるIGF中和抗体の治療効果を比較、検討し、血清Free IGFのプロファイルを検証して、バイオマーカーとしての有用性について検討する。