2018 Fiscal Year Research-status Report
MFG-E8による制御性B細胞を介した腫瘍免疫回避機構の解明と大腸癌治療への応用
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17K09383
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
川島 耕作 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 講師 (10609267)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石原 俊治 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (80263531)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | MHG-E8 / 制御性B細胞（Breg) / 腫瘍免疫 / 大腸癌治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究で、分泌蛋白であるMFG-E8がアポトーシス細胞の貪食促進を介して腸管炎症抑制を誘導すること、一方で、新規のB 細胞サブセットである制御性B 細胞（Breg）が腸管免疫を負に制御することが明らかとなった。この結果を踏まえて、MFG-E8がBregの発生や機能を制御し、腫瘍免疫にも関わる可能性を推測し実験計画を立て研究を進めている。最初に、MFG-E8がBregの発生や分化に影響を与える可能性を考え、MFG-E8欠損マウスにおけるBreg機能を解析し、以後は、大腸癌の発生・進展過程を継時的に追うことができるマウス発癌モデルを作成することを目指した。本研究の継続と成果によって、MFG-E8 あるいはBreg を標的とした新規の大腸癌治療法開発を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
アポトーシス細胞の貪食機能が低下しているMFG-E8 KOマウスを用いて検討をおこなった。本実験は平成29年度からおこなっていたが、実験回数を増やして再検証することで、Bregの発生や分化におけるMRG-E8の機能の詳細を明らかとした。
KOマウスから分離したB細胞分画を用いて、Breg の分化・誘導に関する検討をおこなった。 MFG-E8 KO マウス(C57BL/6 background)は、動物実験専門委員会の許可、DNA 組み 換え実験の許可を得て、理化学研究所を通じて既に入手済みであり、これまでも他の実験に用いておえり、繁殖や飼育を継続してマウスを維持している。KOおよび野生型（WT）マウスから脾臓と腸間膜リンパ節（MLN）を摘出し、フローサイトメーター（FACS）によってBreg分画（CD1dhiCD19hi）の解析をおこない、Bregの発生や分化について両マウス間で比較した。さらに、両マウスの脾臓とMLNから分離したB細胞を培養し CpG DNAで刺激後のIL-10 産生を FACS と EIA で評価 した。。
本検討から、KOマウスの脾臓とMLNでBregの総数はWTに比べて少なかった。in vitroでCpG DNAで刺激した場合にも、KOマウスでBregの頻度が少なく、IL-10産生能も低下していた。以上の結果から、MFG-E8の欠損がB細胞のBregへの分化や誘導を低下させることが示唆され、このことは、BregのIL-10産生を介した免疫制御機能にも影響を与える可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度はMFG-E8 KOマウスとWTマウスから分離したB細胞を用いて、主にin vitroの系で、Bregの分化・誘導に関するMFG-E8の影響を検討した。今後は、大腸発癌過程における MFG-E8 の腫瘍免疫への関与に関する検討をおこなっていく。具体的にはKOおよびWTマウスを用いて大腸癌モデルを作成することとしていた。
大腸癌モデルについては、①Colitic cancer および②sporadic cancerモデルの2種類を既報に基づいて作成する。WTおよびMFG-E8 KO に対して、AOM（1mg/kg）と1.5-2.5% DSS の反復投与により炎症性大腸癌モデル（①）、AOMのみを7日ごとに6回反復投与し約30 週後に形成される 散発性大腸癌モデル（②）を作成する。大腸を摘出後にホルマリン固定 し、形成された腫瘍をメチレンブルーで染色した標本で腫瘍の個数および大きさを評価する。
続いて、大腸発癌過程におけるMFG-E8の腫瘍免疫への関与に関する検討をおこなう。 Rag2マウスとKOあるいはWTと交配させたマウスを樹立する（A. Rag2 x WT 、B. Rag2 x MFG-E8 KO）。樹立したマウスに①および②の大腸癌モデルを作成し、形成された腫瘍を実態顕微鏡下で 観察し、腫瘍の個数および大きさを評価する。Rag2マウスはT、B、NKT細胞を欠失したマウスであり、癌発生あるいは癌浸潤過程において、腫瘍免疫が誘導されないと考えられる。Rag2 x MFG-E8 (KO)マウスで Rag2 x WTに比べて腫瘍発生あるいは増殖が抑制すされれば、MFG-E8が個体の腫瘍免疫抑制を介して腫瘍発生に関わることが検証できる。
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| Causes of Carryover |
平成29年度からおこなっていたin vitroの実験の結果について再検証をおこない、その結果を踏まえて腸癌モデルを作成することとしていた。しかし、Breg の分化・誘導におけるMFG-E8 の関与に関するin vitroの実験の再検証に予想以上に時間を費やし、また、MFG-E8 KOマウスの繁殖が予定通りに進まず、大腸癌モデル作成までに至らなかったことなどが原因であったと考えている。以上のことから、平成30年度についてもin vitroの実験が中心となり、経費の多くは、細胞分離や培養系、各種抗体などの消耗品に用いた。したがって、平成３０年度は、Rag2マウスを購入し、大腸癌モデル作成およびその免疫学的背景を詳細に検討する予定であったが、この部分の実験が進まなかったことで、予定していた実験費用を次年度へ繰り越すこととなった。
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[Journal Article] Capabilities of fecal calprotectin and blood biomarkers as surrogate endoscopic markers according to ulcerative colitis disease type2019
Author(s)
Sonoyama H, Kawashima K, Ishihara S, Kotani S, Fukuba N, Oka A, Kusunoki R, Tada Y, Mishima Y, Oshima N, Moriyama I, Yuki T, Onishi K, Kinoshita Y
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Journal Title
J Clin Biochem Nutr
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed
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