Immunophoto therapy targeting cancer stem cell in colorectal cancer

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09385
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 六車 直樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (90325283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高山 哲治 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10284994) ; 岡本 耕一 徳島大学, 病院, 講師 (60531374)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: がん幹細胞 / 光免疫治療 / 大腸癌

Outline of Annual Research Achievements

１．ヒト大腸癌オルガノイドに関する検討
10症例の大腸癌オルガノイドの樹立ならびに継代培養に成功した。がん幹細胞マーカーである、LGR5、CD133、CD44v6に対して免疫染色ならびにフローサイトメトリーを行い、発現量を評価した。発現量は個体により様々であることが確認された。また、大腸癌のキードラッグである5-FUおよびオキサリプラチンを用いて50%阻害濃度（IC50）による薬剤耐性を評価するとともに、ヌードマウスにオルガノイドを移植し、増殖能および薬剤耐性を評価した。薬剤耐性を比較した結果、IC50は大腸癌オルガノイドが大腸癌細胞株より高値であった。これは大腸癌オルガノイドが、分化した癌細胞よりも薬剤抵抗性が高いこと、つまり癌幹細胞の性質を有していることが示唆された。フローサイトメトリーの結果を照合すると、Lgr5陽性細胞陽性細胞中でCD133陽性率が高いものは薬剤感受性が高く、CD133陽性率が低いものが薬剤耐性に関わっている可能性が考えられた。
２．光線免疫療法について
消化管間葉系細胞であるGIST細胞株を用い、IR700-c-KIT抗体(12A8)抗体反応下に近赤外レーザーを照射したところ、照射量依存的に細胞生存率の低下を認め、100J/cm2照射で0%となった。また、Annexin V (+) 細胞の増加とcleaved PARPの発現増加を認め、アポトーシスによる細胞死が示唆された。ヌードマウスにGIST細胞を移植後、IR700-12A8を静脈投与した。続いてレーザー照射を定期的に行い、腫瘍の縮小率をコントロール群とで比較した。全治療マウスで90%以上の腫瘍縮小率が得られ，そのうち4匹では腫瘍が完全に消失した。TUNEL染色によるApoptotic Indexは，対照群 (約3%) に対して治療群 (約58%) で有意に高かった (p＜0.01)。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト大腸癌よりオルガノイドの培養・継代を行う技術は安定し、ライブラリー構築が順調に進んでいる。ソーティングによるLGR5発現細胞、CD133発現細胞の数が十分に収集できるように工夫が必要であるが、現時点では代替細胞として消化管間葉系細胞を用いて光免疫治療の基盤技術の確立を行っており、照射量依存性に効果があがることが確認された。

Strategy for Future Research Activity

今後は大腸癌幹細胞からLGR5陽性細胞あるいはCD133陽性細胞をソーティングするとともに、それぞれの陽陰性分画で薬剤耐性、細胞増殖能をin vitroで評価する。続いて小動物に各オルガノイドを移植し、in vivoレベルで同様に評価を行う。今年度の実績で確立された光免疫療法技術をオルガノイド移植マウスに行い、大腸癌幹細胞の抑制実験を進める。

Causes of Carryover

研究全体としてはおおむね順調に進行しているが、治療における光用量を決定するための小動物実験をパイロット的に行ったことから当初予定より引数が少なくなった。より正確なデータを得るために次年度小動物実験は総数を若干増やすことを検討しているが、予算範囲内での研究遂行が可能と判断している。