肝癌幹細胞のエキソソーム分泌を介した微小環境調節の新規機序の解明と治療応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09401
• Research Institution: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小暮 高之 東北医科薬科大学, 医学部, 講師 (70400330)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 賢治 旭川医科大学, 大学病院, 助教 (00736332) ; 嘉数 英二 東北大学, 大学病院, 助教 (20509377)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 肝細胞癌

Outline of Annual Research Achievements

化学療法耐性の主因である癌幹細胞とその微小環境は有望な治療標的であり、我々はこれまでに、肝癌の癌幹細胞がEpCAM陽性分画に存在することを証明し、さらに、肝癌細胞がエキソソームを用いて機能性RNAを輸送することによりその微小環境を調節することを明らかにした。本研究では、肝癌幹細胞のエキソソームを介した微小環境の調節機構を解明し、介在する機能性RNAを同定したうえで、このRNA分子の阻害剤の抗腫瘍効果を明らかにし、RNA創薬としての臨床応用をめざす基盤を確立することを目的とする。
肝癌細胞株PLC/PRF/5, Hep3B, Li7をセルソーターを用いてEpCAM陽性細胞、陰性細胞に分離回収し、超低接着表面加工のプレートに特殊培地を用いて培養した。EpCAM陽性細胞群はスフェロイド状の細胞集塊を形成が認められた。培地交換を3-4日ごとに行うことで、このスフェロイド状の細胞は、少なくとも2週間の培養が可能であった。EpCAM陰性細胞では細胞集塊の出現はなかった。
一方、セルソーターを用いずに特殊表面加工のプレートに幹細胞用培地を用いて培養し、形成された細胞集塊を回収して新たなプレートに継代することを複数回繰り返した。集塊を形成した細胞のEpCAM陽性率は約80％と高率であり、セルソーターを用いた場合と同様に癌幹細胞が濃縮されていると思われた。
肝癌細胞株PLC/PRF/5を後者の方法で調整し、培養上清中のエキソソームからRNAを抽出した。コントロールとして通常の単層培養を行ったPLC/PRF/5の培養上清からエキソソーム回収し、RNAを抽出した。エキソソーム中のRNA (microRNAとlong non^coding RNA)を網羅的に解析する予定だったが、解析に十分な品質と量のRNAが回収できず、検討を繰り返した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

2017年4月に前勤務地の東北大学大学院消化器病態学分野から現勤務地の東北医科薬科大学に異動した。新設医大の立上げのための診療・教育業務の負担が大きく、研究に従事する時間を少なくせざるを得なかったこと、主要な研究施設が現勤務地に変更となり、現勤務地の研究室の機材が未整備のため、前勤務地でエキソソーム解析などの実験を行わなければならなかったことにより、計画の遅延が生じた。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通りに遂行する予定だが、上記の理由で大幅な遅れが生じており、解析する細胞株の種類を少数に絞って解析する。

Causes of Carryover

平成31年度に予定していた肝癌幹細胞の分泌するエキソソームに特異的なRNA 分子を同定する網羅的検討を行えなかったため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は令和2年度の助成金と合わせて、肝癌幹細胞の分泌するエキソソームに特異的なRNA 分子を同定する網羅的検討に係る次世代シーケンスとlong non-coding RNAカスタムアレイの費用として使用する計画である。