肝癌幹細胞のエキソソーム分泌を介した微小環境調節の新規機序の解明と治療応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09401
• Research Institution: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小暮 高之 東北医科薬科大学, 医学部, 講師 (70400330)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 賢治 旭川医科大学, 大学病院, 助教 (00736332) ; 嘉数 英二 東北大学, 大学病院, 助教 (20509377)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肝細胞癌

Outline of Annual Research Achievements

癌幹細胞とその微小環境は化学療法耐性の主因と想定され、有望な治療標的である。本研究では、肝癌幹細胞のエキソソームを介した微小環境の調節機構を解明し、介在する機能性RNAを同定したうえで、このRNA分子の阻害剤の抗腫瘍効果を明らかにし、RNA創薬としての臨床応用をめざす基盤を確立することを目的とする。
肝癌細胞株PLC/PRF/5, Hep3B, Li7をセルソーターを用いてEpCAM陽性細胞、陰性細胞に分離回収し、超低接着表面加工のプレートに特殊培地を用いて培養した。EpCAM陽性細胞群はスフェロイド状の細胞集塊形成を認めたが、この方法ではエキソソームを抽出するのに十分な量の培養上清を得ることが出来なかった。
エキソソーム抽出を目的に肝癌幹細胞の細胞集塊の大量培養の方法を検討した。セルソーターを用いずに特殊表面加工のプレートに幹細胞用培地を用いてPLC/PRF/5細胞を培養し、形成された細胞集塊を回収して新たなプレートに繰り返し継代した。集塊を形成した細胞のEpCAM陽性率は約80％と高率であり、セルソーターを用いた場合と同様に癌幹細胞が濃縮されていると考えたれた。この培養上清よりエキソソームを回収してRNAを抽出した。コントロールとして通常の単層培養のPLC/PRF/5からエキソソーム回収した。エキソソーム中に比較的安定して存在するsnoRNA U43, 18S ribosomal RNAを定量PCRで検出するも、単層培養由来のエキソソーム中の発現量と比較して癌幹細胞由来のエキソソーム中のその発現量が極めて低く、抽出したエキソソームおよびRNAが解析に十分な品質でないと推測された。肝癌細胞Hep３B, HepG2を用いて行うも同様で、幹細胞の培養方法の問題であろうと推測された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

2017年4月に前勤務地の東北大学大学院消化器病態学分野から現勤務地の東北医科薬科大学に異動した。新設医大の立上げのための診療・教育業務の負担が大きく、研究に従事する時間を少なくせざるを得なかったこと、主要な研究施設が現勤務地に変更となり、現勤務地の研究室の機材が未整備のため、前勤務地でエキソソーム解析などの実験を行わなければならなかったことにより、計画の遅延が生じた。肝癌幹細胞の培養上清中のエキソソーム解析で解析に十分な品質のRNAが回収できず、計画に遅延が生じた。さらに、COVID-19による診療の負担増、実験の自粛が求められた時期があり、遅延が生じた。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通りに遂行する予定だが、上記の理由で大幅な遅れが生じており、細胞株の種類を少数に絞り、解析するRNAの種類を限定して行う。

Causes of Carryover

令和２年度に予定していた肝癌幹細胞の分泌するエキソソームに特異的なRNA 分子を同定する網羅的検討を行えなかったため、次年度使用額が生じた。
肝癌幹細胞の分泌するエキソソームに特異的なRNA 分子を同定する網羅的検討に係る次世代シーケンスとlong non-coding RNAカスタムアレイの費用として使用する計画である。