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2017 Fiscal Year Research-status Report

Investigation of the roles of bone marrow-derived fibroblasts/myofibroblasts and their molecular mechanism in the carcinogenesis of mouse models of pancreatic cancer

Research Project

Project/Area Number 17K09460
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

高石 繁生  京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20596829)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords膵癌発症複合遺伝子変異マウス
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、大別して下記の2つの命題について、膵癌を自然発症する複合遺伝子変異マウス(以下、膵癌マウスと略称)を用いて解析することを主眼としている。A. 膵癌マウスにおける骨髄由来腫瘍関連線維芽細胞および筋線維芽細胞の役割を明らかにする。B. 膵癌マウス発癌におけるCyclooxgenase-1, -2遺伝子(以下、Cox-1, -2と略記)の役割を明らかにする。
初年度である平成29年度は、研究を遂行する上で必要となる各種の遺伝子改変マウスの獲得と繁殖・維持および交配を行い、現在も進行中である。初年度に獲得した遺伝子改変マウスとその提供元は以下のとおりである。1) 膵臓特異的Creリコンビナーゼ発現ノックインマウス(Ptf1a-Creマウス) 2) 条件的活性変異型K-rasG12D発現ノックインマウス(LSL-KrasG12Dマウス) 3) 条件的p53遺伝子ノックアウトマウス(p53 floxマウス) 4) 条件的Cox-1遺伝子ノックアウトマウス(Cox-1 floxマウス) 5) 条件的Cox-2遺伝子ノックアウトマウス(Cox-2 floxマウス) 6) 全身的eGFP発現トランスジェニックマウス(CAG-EGFPマウス)
提供元:1) 2) 4) 5)は研究協力者である京都大学医学部消化器内科・妹尾浩教授および福田晃久助教、3)は米国ジャクソン研究所から有償にて購入、6)は理化学研究所バイオリソースセンター・実験動物開発室。なお、マウス分譲に関して、4)は作製者である神戸大学医学部薬理学・古屋敷智之教授の、6)は作製者である大阪大学微生物病研究所附属遺伝情報実験センター・伊川正人教授の承諾を得た。
テーマBに関しては、上記に加えてヒト膵癌におけるCOX-1,-2遺伝子の機能も解析できるようにするため、各種のヒト膵癌培養細胞株を理研細胞バンクやJCRB細胞バンク等から入手した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前述の、「研究実績の概要」にも記したとおり、本研究は2つのテーマからなるが、平成29年度は、主に研究遂行に必要となる遺伝子改変マウスの収集と繁殖・交配、およびヒト膵癌培養細胞株の入手に専念した。
特に、3) p53 floxマウスは海外の研究機関から購入したため、申請者が所属する動物実験施設のSPF領域への搬入のため、マウスのクリーン化(SPF化)に約3か月を必要とした。
現時点では、1) Ptf1a-Creマウス、2) LSL-KrasG12Dマウス、3) p53 floxマウス)、の3種類のマウスを交配中である。また、4) Cox-1 floxマウス、
5) Cox-2 floxマウス、6) CAG-EGFPマウスは、それぞれ順調に繁殖しており、4) 5) は今後、1) 2) 3)の複合変異マウスと交配させる予定である。
ヒト膵癌培養細胞株に関しては、計22種の細胞株を入手して血清添加培地にて培養を行い、細胞が問題なく増殖することを確認した。加えて、血清無添加培地(増殖因子EGF, bFGF,と添加物B-27のみ添加)+非接着条件によるスフィア・アッセイを実施した結果、7種の細胞株でスフィアを形成することを同定した。従って、これらの細胞株は癌幹細胞分画を含む可能性が高いことが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

前述の「現在までの進捗状況」にも記したとおり、平成29年度は、主に研究遂行に必要となる遺伝子改変マウスの収集と繁殖・交配、およびヒト膵癌培養細胞株の入手に専念した。
現時点では、1) Ptf1a-Creマウス、2) LSL-KrasG12Dマウス、3) p53 floxマウス)の3種類のマウスを交配中であり、平成30年度は1) 2) 3)の遺伝子複合変異マウスを解析して、膵発癌を確認する。
並行して、4) Cox-1 floxマウス、および5) Cox-2 floxマウスを、この複合変異マウスと各々交配させる予定である。加えて、6) CAG-EGFPマウスを骨髄ドナーとし、1) 2) 3)の遺伝子複合変異マウスをレシピエントとして、骨髄移植の実験を施行する予定である。
ヒト膵癌培養細胞株に関しては、COX-1,-2遺伝子の発現状況を、定量的PCR法(mRNAの定量化)やウエスタンブロッテイング法(タンパク質の定量化)にて解析する。

Causes of Carryover

前述の「研究実績の概要」にも記載した本研究のテーマA.:「膵癌マウスにおける骨髄由来腫瘍関連線維芽細胞および筋線維芽細胞の役割を明らかにする。」を遂行するためには、様々な遺伝子改変マウスが必要である。その中で、線維芽細胞特異的Creリコンビナーゼ発現マウス(Col1a-CreERTMマウス)は、平成29年度中に入手することが出来なかったので、その購入費用は今年度へ繰り越すこととした。

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Published: 2018-12-17  

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