2017 Fiscal Year Research-status Report

インスリン分泌不全および抵抗性が膵発癌・進展機構に与える影響の解明

Research Project

Project/Area Number	17K09461
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	重川稔大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00625436)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小玉尚宏大阪大学, 医学部附属病院, その他 (10623275) 巽智秀大阪大学, 医学系研究科, 講師 (20397699) 疋田隼人大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20623044)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	膵癌 / 糖尿病 / 動物モデル
Outline of Annual Research Achievements	膵癌は近年増加傾向にある難治癌の1つであり、本邦における癌の死因の第4位となっている。膵癌のリスクファクターの1つとして糖尿病が知られているが、すべての糖尿病患者に対して膵癌のスクリーニング検査を行うことは困難であり、糖尿病患者の中から膵癌高危険群を層別化することは非常に重要な課題である。本研究では、糖尿病におけるインスリン分泌低下、インスリン抵抗性（高インスリン状態）、高血糖状態が膵癌前癌病変であるPanINsの形成や腫瘍増殖、進展に与える影響の解析を行い、糖尿病のどの側面が膵発癌のリスクとなるのかを解明することを目的とした。本年度はまず、野生型マウスにストレプトゾトシンを投与することで高血糖および低インスリン状態となる糖尿病モデルマウスを作製した。当研究室で保有しているKras点変異やp53欠損を膵特異的に伴う膵発癌モデルマウスに対して、同様に薬物、食餌にて低インスリン状態、高血糖状態を誘発したところ、膵前癌病変の進展の促進が確認された。さらに膵発癌モデルマウスから膵癌細胞株を樹立し、既存のヒト膵癌細胞株とともに高血糖および正常血糖培地で培養したところ、Kras変異を有する膵癌細胞株は、高血糖培地において正常血糖培地に比し、細胞増殖能、遊走能、腫瘍形成能の亢進を認めた。高血糖状態や低インスリン状態、高インスリン状態が腫瘍増殖に与えるメカニズムについて次年度以降、動物モデル、細胞株を用いてさらなる検討を加える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初は既存のヒト膵癌細胞株（Panc1、BxPC3）を用いて、in vitroの検討を行う予定としていたが、申請者が保有している膵発癌モデルマウス KrasLSL-G12D/+-ElaCre-Trp53flox/flox, KrasLSL-G12D/+-Pdx1Cre-Trp53flox/floxを用いて既報の方法論に則りマウス膵癌細胞株を樹立し、in vitroの検討に加えた。既存のヒト膵癌細胞株 Panc1 (Kras変異型)、BxPC3(Kras野生型)および作成したマウス膵癌細胞株(Kras変異型)を高血糖(450mg/dL)、正常血糖(100mg/dL)で培養したところ、すべてのKras変異株では高血糖状態はがん細胞内のc-mycの発現を上昇させ、細胞増殖能、遊走能、腫瘍形成能が亢進していた。蛋白レベルにおいて、Kras下流のErkおよびAktのリン酸化は抑制されていた。膵発癌マウスを用いたin vivoの検討に関しては、KrasLSL-G12D/+-Pdx1Creにストレプトゾトシンを投与し、高血糖、低インスリン状態を誘発したところ、12週齢において膵前癌病変であるPanINsの占める面積が増加することが確認され、腫瘍促進が動物モデルにおいても示された。PanINs部の蛋白発現を免疫染色で確認したところ、Erkのリン酸化は変化なく、c-mycの発現増強を認め、高血糖状態、低インスリン状態とc-mycの関連が示唆された。糖尿病誘発マウスの確立、マウス膵癌細胞株の樹立に加え、膵癌細胞株、膵発癌モデルを用いた腫瘍進展の検討も概ね予定通りに進展している。
Strategy for Future Research Activity	膵癌細胞株を用いた検討で高血糖状態における癌細胞内のc-myc発現上昇が細胞増殖に関与している可能性が得られたため、膵癌細胞株を用いてc-mycのノックダウン実験などを行い、高血糖状態における細胞増殖とc-mycの関連性についてさらなる検討を加える。また動物モデルでは、ストレプトゾトシン（STZ）投与に加えて高脂肪食（HFD）負荷を加えることにより、STZ群(インスリン分泌低下)、STZ＋HFD群(インスリン分泌低下＋インスリン抵抗性)、HFD群(インスリン抵抗性)と複数の糖尿病モデルマウスを作製する。申請者が保有する成熟膵腺房細胞でKras変異を誘導するKrasLSL-G12D/+-Ela-CreERマウスと進行膵癌モデルであるKrasLSL-G12D/+-Pdx1Cre-Trp53flox/floxマウスに薬物および食餌にて複数の糖尿病モデルを誘導し、様々な時期の高血糖状態、インスリンの多寡が膵発癌や腫瘍進展に与える影響について評価する。さらに、糖尿病を有する膵癌患者と糖尿病を有さない膵癌患者の患者背景（耐糖能や腫瘍因子など）と治療効果や予後について解析し、糖尿病と膵癌進展に関与する背景因子について検討する。