Genetic analysis of familial pulmonary hypertension with the next generation DNA sequencer

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K09513
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 窪田 佳代子 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (50709863)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大石 充 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (50335345) ; 池田 義之 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00573023) ; 吉満 誠 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (70404530) ; 朝野 仁裕 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60527670)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肺高血圧症 / 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

我々は高い浸透率で肺高血圧症を発症している一家系において未知の疾患関連遺伝子が関与している可能性を考え、同意を得られた9名の検体と既に死亡している2名の病理組織を用い、鹿児島大学と大阪大学医学部医化学講座の異なる2つの次世代シーケンサーを用いて解析を行なった。
鹿児島大学では、PureLink® Genomic DNA Mini Kitを用いて末梢血単核球からゲノムDNAを抽出しIon Ampliseq Library Kit Plusを用いてエクソーム解析用のDNAライブラリーを作成しIon Chefシステムを用いてテンプレート増幅とチップローディングを行いIon protonを用いてエクソンシークエンスを行なった。Variant callerを通して得られたデータは次世代シーケンサー Web 解析システム Cloud Exome SNV screening systemを用いて解析した。
大阪大学ではゲノムDNAを数百bpに物理的に断片化を行い二本鎖DNAの両末端に異なるタグ配列を有するアダプターを付加したDNAライブラリーを作製、ターゲット領域の濃縮はSureSelect Human All Exon V6およびリキッドハンドリングシステムBRAVO等を用いて行った。タグ付き濃縮DNAライブラリーを混合し１つのシーケンスライブラリーとし作製したシーケンスライブラリーについて次世代シーケンサーHiSeqを用いて両末端シーケンスを行った。
最終的に発端者を含む5名と既に死亡している同疾患1名から既存のBMPR2遺伝子が検出された。しかしBMPR2が父系から受け継がれたと想定されるなか、母系にも発症者がいることからBMPR2に加え別の病因関連遺伝子が関与していると推察された。現在ZNF717,MUB5B等遺伝子の絞り込みを行ない関連性を検討中である。