Fabry病の新規αガラクトシダーゼ遺伝子変異による酵素の生体内動態に関する研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09514
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 樋口 公嗣 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90448580)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉満 誠 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (70404530)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Fabry病

Outline of Annual Research Achievements

Fabry病が疑われた症例の血漿中酵素活性は正常であったが、白血球中酵素活性は低下している症例におけるα-gal A遺伝子変異は、一塩基置換されたもので、この置換により異なるアミノ酸となるミスセンス変異であった。この変異をα-gal A-mutと名付け、レンチウイルスベクターを用いてα-gal Aとα-gal A-mutをHeLa細胞で過剰発現させ、in vitroで同様の現象が観察されるか確認した。その結果、培養上清中では、α-gal A酵素活性はα-gal Aおよびα-gal A-mutともに上昇していたが、白血球中つまり細胞内のα-gal A酵素活性はα-gal Aでは上昇していたが、α-gal A-mutでは上昇せず、臨床的に起きている事象を再現することができた。α-gal A-mutでの変異は先述したようにアミノ酸の置換が起こるミスセンス変異であったが、アミノ酸は中性から酸性アミノ酸へ置換されている。このアミノ酸置換が塩基性アミノ酸に置換された場合（α-gal A-mut2）やα-gal A-mutとは違う酸性アミノ酸への置換（α-gal A-mut3）では、血漿中や細胞内でのα-gal A酵素活性はどうなるか不明であり、α-gal A酵素の動態を確認するため、α-gal A-mut2およびα-gal A-mut3変異体のレンチウイルスベクターの作製を行ってきが、mutagenesisを利用した塩基置換が成功せず、その後も繰り返しているがベクター作製ができていない状況である。mutagenesisを行う際のPCRでは温度やMg濃度を検討しているが塩基置換に成功せず、ベクター作製ができていないため次の実験へ進むことができていない状況である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上記の通り、実験で使用するベクター作成ができていないため次の実験へ進むことができていない。

Strategy for Future Research Activity

変異体ではないベクターはできており、変異体のベクター作製を早急に行う。ベクター作製が完成すればin vitroの実験へ進むことが可能であり、その結果をもとにin vivo実験まで行う予定である。mutagenesisのキット変更や試薬の再調整も行う予定である。

Causes of Carryover

ベクター作製に遅れが出たため、ベクター作製後の実験での使用分の一部が、次年度使用額として生じてしまった。