新規心臓特異的プロテインキナーゼが修飾する生理機能の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09571
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 竹藤 幹人 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (20709117)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 天野 睦紀 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: キナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

細胞内では遺伝子発現、分子間結合、糖・脂質代謝などによりシグナルが伝達され、生体の恒常性を維持している。分子間結合は主要な細胞内シグナル伝達であり、共有結合による分子間結合に加え、非共有結合による分子間相互作用は様々な生理機能を調節している。プロテインキナーゼによるタンパク質のリン酸化は非共有結合性のシグナル伝達の代表例であり、in vitroおよびin vivo手法を用いて多様な生理現象との関連が報告されてきた。プロテインキナーゼはタンパク質をリン酸化し、タンパク質の構造・性質を大きく変化させ、タンパク質もしくはシグナル伝達経路全体を活性化もしくは不活性化させている。何らかの原因によりプロテインキナーゼの酵素活性が低下し、タンパク質リン酸化のバランスが崩れると、正常な生理機能が抑制され、生体の恒常性維持が困難となる。反対に、過剰なリン酸化は、細胞内に病的なシグナルを生じさせ、過剰な細胞増殖や細胞収縮を引き起こし、悪性腫瘍や高血圧などの疾患を発症することが知られている。過剰なリン酸化は疾患発症に関与していることから、プロテインキナーゼは治療のターゲットとしても注目されている。心臓におけるプロテインキナーゼの役割は不明な点が多い。本研究では、心筋特異的に発現するプロテインキナーゼを同定し、その生理機能を明らかにすることを目的としている。
平成29年度は、PKA、AKT、CaMKによる過剰なリン酸化が心不全発症に関与することを論文報告した（J Exp Med 2017年）。また、PKAやAKTなどはユビキタスに発現するため、心不全特有の細胞内シグナルを探索するため、心臓特異的に発現するプロテインキナーゼを同定した。プロテインキナーゼの機能解析を進める上で有用な実験ツールである、遺伝子欠損マウスを作製した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

心臓は全身に血液を送るポンプ機能として絶えず収縮と弛緩を繰り返していることから、心臓では細胞内シグナル伝達のオン・オフのスイッチ機構が絶えず働いていると推察される。プロテインキナーゼによる基質のリン酸化は、細胞内シグナル経路の律速反応として機能していることが広く知られている。本研究では、ヒト遺伝子にコードされている全518種のプロテインキナーゼを網羅的解析し、心臓特異的に発現する新規プロテインキナーゼを同定し、また、プロテインキナーゼによるリン酸化が心臓のどのような生理機能を制御しているかを明らかにする。分子の発現量を解析する新たな方法としてnCounter法が報告された（Nature Biotechnol 2008年）。従来のPCR法では、RNAの相対的発現量は測定可能であったが、RNAの絶対的発現量の測定が困難であったため、異なる分子の発現量を網羅的に比較することは出来なかった。nCounter 法では各遺伝子のRNAに特異的に結合する発色プローブを用いることにより、RNA量の絶対量を測定することが可能となった。心臓特異的プロテインキナーゼを目的とした予備実験では、ヒト17組織におけるプロテインキナーゼ（518種）の発現量をnCounter法により測定した。心臓特異的かつ強発現するプロテインキナーゼとしてミオシン軽鎖リン酸化酵素（MYLK3）とCardiac Kinase Xを同定した。Cardiac Kinase Xは、遺伝子コードからその存在が予測されているが、基質・機能の報告がない機能未知な分子である。MYLK3の生理的機能については既に報告されているため、本研究ではCardiac Kinase Xに注目し、研究を進めている。

Strategy for Future Research Activity

本研究ではCardiac Kinase Xの機能を下記実験により明らかにする。
①Cardiac Kinase X局在の評価：前述した心臓に発現するプロテインキナーゼの網羅的解析に加え、ヒト各組織おけるCardiac Kinase Xの局在をnCounter法とin situ hybridizationにより予備実験として検討している。nCounter法では心筋に強発現することを確認し、in situ hybridizationによる評価では、胎生18日齢のマウスでは右心房のみに強発現し、8週齢では右心房の房室結節に局在が集約していた。正常心におけるCardiac Kinase Xの局在に加え、心不全・心筋梗塞などの心疾患発症時のCardiac Kinase Xの局在を評価する。心不全発症により、心室における発現が上昇するかを評価する。
②心筋特異的Cardiac Kinase X KOマウス作製：CRISPR-Cas9システムを用いて、Cardiac kinase Xの全身KOマウスと心筋特異的KOマウスを作製している。全身KOマウスについては作製を終了し、心筋特異的KOマウスについては作製を継続する。
③in vivo解析（Cardiac Kinase Xの生理的機能解析）：（A） 心奇形・房室伝導の評価：全身KOマウスは野生型と同様に生まれ、生育していることから、胎生致死をきたすような心奇形は生じていないと考えている。今後は、心電図、心臓超音波検査を用いて、成体の全身ＫＯマウスの心機能評価を行う。特にCardiac Kinase Xが強発現する房室結節の機能を解析し、不整脈発症の関与について評価する。（B） 心不全・心筋梗塞の評価：圧負荷モデルもしくは心筋梗塞モデルを用いた心不全において、Cardiac kinase X KOマウスがどのような病態と関与するかを評価する。

Causes of Carryover

平成29年度～平成30年度に年度にまたぐ、実験解析を行っており、解析中の実験費用の一部を次年度の使用分とした。

Research Products

• [Journal Article] Corticotropin releasing hormone receptor 2 exacerbates chronic cardiac dysfunction. (2017)
  • Author(s): Tsuda T, Takefuji M, Wettschureck N, Kotani K, Morimoto R, Okumura T, Kaur H, Eguchi S, Sakaguchi T, Ishihama S, Kikuchi R, Unno K, Matsushita K, Ishikawa S, Offermanns S, Murohara T.
  • Journal Title: The Journal of Experimental Medicine Volume: 214 Pages: 1877-1888
  • DOI: 10.1084/jem.20161924.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research