2017 Fiscal Year Research-status Report
PKG1αロイシンジッパーを介した動態制御の解明と心不全治療の応用
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17K09583
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中村 太志 熊本大学, 医療情報経営企画部, 准教授 (60582947)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉家 康宏 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (10515414)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | PKG / 心不全 / システイン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
従来の標準的心不全治療と比べ優れた予後改善効果を示す治療戦略として、細胞内サイクリックGMP(cGMP)のレベル増加を介した心血管保護作用が期待されている(N Engl J Med. 2014)。cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)は、cGMPシグナル伝達の薬理作用を仲介する主要なエフェクター分子として報告されているが、治療標的薬としての開発には至っていない。
心血管組織に発現するアイソザイムPKG1αはcGMPの結合で活性化するホモ二量体のリン酸化酵素である。しかし、PKG1αのN末端近傍に位置する42番目のシステイン残基(C42)が酸化修飾されるだけで、cGMP非依存性にも調節を受ける機構が報告され、心血管における意義が注目されている(Science. 2007, Nat Med. 2012)。筆者は、PKG1αのC42を介すジスルフィド架橋による二量体化が心臓でもみられ、酵素活性レベルに関わらず分子本来の抗肥大作用を妨げ(Loss-of-function)、細胞内局在や基質相互作用を変化する新たな制御機構を明らかにした (Nakamura T. et al, J Clin Invest. 2015)。また、PKG1αのジスルフィド二量体化は、cGMPを加水分解するホスホジエステラーゼ5(PDE5)のS92リン酸化活性に必要な構造変化であり、既存のPDE55阻害薬の応答性に重要な役割を果たしていることがわかってきた (Nakamura T. et al, Circ Heart Fail. 2018)。
PKG1αレドックス制御機構に焦点をあてたcGMP/PKGシグナルの研究は、心不全治療の新規標的としての確立を目指すだけでなく、肺高血圧治療薬として使用されるPDE5阻害薬の応答性にも関わる臨床有用性の高い研究である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
野生型PKG1αマウスとC42をセリンに置換したレドックス非感受性のPKG1αノックインマウスを用い、横行胸部大動脈縮窄による圧負荷誘導性の心肥大・心不全モデルを作製した。摘出肥大心からランゲンドルフ灌流装置を用いて単離した心筋細胞を用いて、免疫組織学的にPKG1αの細胞内局在を検討した。既報同様、びまん性に発現分布するPKG1αは、エンドセリン1や圧負荷刺激により細胞膜に移行する現象を確認した。しかし、一旦細胞膜に移行したPKG1αは慢性刺激下で局在を細胞質に戻す一方、レドックス非感受性のPKG1αは長時間にわたり細胞膜分画に留まることがわかった。
マウス心筋細胞以外での再現性を確認するため、PKGコンストラクトと組換えアデノウイルスの作製を行った。予定より時間を要したが、まずFLAGを融合したヒトの野生型PKG1αWTとレドックス非感受性のPKG1αC42Sのコンストラクトを作製した。次に、コンストラクトの塩基配列をシークエンス解析で確認した後、PKG1αの組換えアデノウイルスの増殖作製を行った。作製したPKGは細胞株やラット心筋細胞に導入し、免疫組織学的ならびに細胞分画抽出法によりPKG1αの細胞内局在を検討した。ジスルフィド二量体のPKG1αは常に細胞質分画に安定して存在する一方で、細胞膜に移行したPKG1αは単量体のみであることがわかった。また、これらの局在パターンは選択的PKG1α阻害薬のDT3添加により変化しなかったため、キナーゼの活性レベルで調節されるわけではなく、N端立体構造変化の関与が強く示唆された。そのため、ジスルフィド架橋は形成しないが、構造的にジスルフィド酸化型を模倣することがX線小角散乱による構造解析ですでに示されているPKG1αC42L作製をさらに計画し、細胞内局在化シグナルにおけるN末端ロイシンジッパー構造の意義について検討を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
FLAGタグを融合標識したヒトの野生型PKG1αWTや還元型PKG1αC42S、酸化型を模倣したPKG1αC42Lの組換えアデノウイルスを用いて、細胞株および新生仔ラット心筋細胞にPKG1αを導入し、疎水性クロマトグラフィにより疎水性変化を比較検討する。また、同様にPKG1αを導入した細胞モデルを用い、PKG1αチオール基のパルミトイル化修飾と細胞膜局在化の可逆性についても検討する。実験は、パルミトイル化あるいはパルミトイル化阻害剤により脱パルミトイル化した細胞条件下で、蛍光免疫染色および細胞分画タンパク質抽出によりPKGの局在を比較検討する。最終的には、C42のPKG1α変異体を発現する細胞を比較することで、C42部位におけるS-パルミトイル化の意義を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
予定した試料の作製に時間がかかり、実験計画の進行が遅れている。研究計画の遂行のため、次年度での使用を予定している。
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