2018 Fiscal Year Research-status Report
PKG1αロイシンジッパーを介した動態制御の解明と心不全治療の応用
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17K09583
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中村 太志 熊本大学, 大学病院, 准教授 (60582947)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉家 康宏 熊本大学, 大学病院, 非常勤診療医師 (10515414)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | プロテインキナーゼG / レドックス / 病的心肥大 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内サイクリックGMP(cGMP)とそのエフェクター分子であるcGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)を介した心血管保護効果の治療応用が期待されている。心血管組織に発現するアイソザイムPKG1αは、原則cGMPの結合で惹起される構造変化により活性化されるホモ二量体のリン酸化酵素である。しかし、PKG1αのN端近傍に位置する42番目のシステイン残基(C42)が特異的に酸化修飾されるだけでも、ジスルフィド架橋により二量体化しcGMP非依存性に調節を受ける機構が報告され、心血管における意義が注目されている。筆者は、ヒトの高血圧性不全心やマウスの圧負荷誘導性肥大心、高頻拍ペーシングにより誘発される犬の不全心においてジスルフィド架橋を介すPKG1α二量体化が増加することを見出し、酵素活性レベルに関わらず分子本来の抗肥大作用が減弱されること(Loss-of-function)を明らかにし報告した。また、C42を介す新たな機序として、レドックス依存性にPKG1αの細胞内局在が変化することと基質相互作用が変化する制御機構を見出し報告した (Nakamura T. et al, J Clin Invest. 2015)。しかし、病的心肥大、心不全における標的有用性に関する報告が多数あるにも関わらず、PKGを直接標的とした創薬には至っていない。本研究は、既報に基づき、局在化シグナルの機構解明および抗肥大作用におけるcGMPシグナルの層別化に焦点をあて、心不全治療におけるPKG1αの標的有用性の確立と治療応用を目指す研究である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PKG1αは心筋細胞内にびまん性に発現しているが、エンドセリン1や圧負荷刺激で一過性に細胞膜へ移行したのち、慢性刺激下で細胞質分布に戻る。この再現性を確認するため、FLAGを融合したヒトの野生型PKG1αとレドックス非感受性のC42S PKG1αのコンストラクトを作製。また、その塩基配列をシークエンス解析で確認した後、組換えアデノウイルスを作製した。細胞株やラット心筋細胞にヒトPKGを導入し、免疫組織学的ならび細胞分画抽出法でPKG1αの細胞内局在を評価した。ジスルフィド二量体のPKG1αは細胞質分画に安定して存在する一方で、細胞膜に存在したPKG1αは還元体であった。この局在パターンは選択的PKG1α阻害薬の添加で変化しなかったため、キナーゼの活性レベルに依らず、C42を介した局在化シグナル機構の存在が示唆された。ヒトのPKG1αコンストラクトを用い、C42酸化によるPKG1αN末端の疎水性変化およびパルミトイル化酵素共処理による局在性変化の可能性について検討を重ねている。
また、PKGの細胞内動態がcGMPシグナルの層別化にどのように影響を与えるのか、cGMPレベルを増やす既存薬の応答性について検討した。PKG1αのジスルフィド二量体化は、ホスホジエステラーゼ5(PDE5)のS92リン酸化活性に必要で、PDE55阻害薬の応答性に重要である一方、可溶性グアニル酸シクラーゼ活性化薬はレドックス状態に依らず抗肥大作用を発揮することがわかった (Nakamura T. et al, Circ Heart Fail. 2018)。また、アダルトラット心筋細胞を用いたリン酸化プロテオーム解析によりチュベリン(TSC2)上に新たなPKGリン酸化部位を同定し、心肥大におけるTSC2/mTOC1シグナル経路の意義を報告した(Ranek MJ. et al, Nature.2019)。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究に付随し発展した関連テーマとして、cGMPシグナルの層別化解析および新規PKGリン酸化部位の機能解析を共同研究で実施し、得られた研究成果を報告した。次年度は、FLAGタグを融合標識したヒトの野生型PKG1αWTとレドックス非感受性PKG1αC42Sの組換えアデノウイルスを用いて、細胞株および新生仔ラット心筋細胞にPKG1αを導入し、疎水性クロマトグラフィ分離により疎水性変化を比較検討する。また、同様にPKG1αを導入した細胞モデルを用い、PKG1αチオール基のパルミトイル化修飾と細胞膜局在化の可逆性について、パルミトイル化酵素によるパルミトイル化処理あるいはパルミトイル化阻害剤による脱パルミトイル化処理した細胞条件下で蛍光免疫染色および細胞分画タンパク質抽出で比較検討する。C42のPKG1α変異体を発現する細胞との比較で、C42を介すPKG局在性変化におけるS-パルミトイル化の意義を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
実験計画の一部で進行が遅れ、また関連する共同研究の成果を優先して報告するために調整が必要であった。研究課題を完遂するため、次年度での使用を予定している。
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[Journal Article] PKG-mediated TSC2 regulates mTORC1 activity to counter adverse cardiac stress.2019
Author(s)
Ranek MJ, Kokkonen-Simon KM, Holewinski R, Lee DI, Chen A, Vera MP, Dunkerly-Eyring B, Patel C, Nakamura T, Zhu G, Bedja D, Sasaki M, Van Eyk J, Oeing C, Powel J, Kass DA.
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Journal Title
Nature.
Volume: 566
Pages: 264-269
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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