2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel therapeutic approach for diabetic cardiomyopathy by modification of AMP deaminase activity.
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17K09584
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
丹野 雅也 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00398322)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 俊之 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40444913)
三浦 哲嗣 札幌医科大学, 医学部, 教授 (90199951)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 糖尿病性心筋症 / 心不全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病性心筋症は、発症早期には左室拡張機能障害を呈し、左室収縮能の維持された心不全(HFpEF)の主要な原因の一つである。糖尿病患者の急激な増加とともに本症も増加の一途を辿るが、現時点では特異的な治療法は無い。我々は、2型糖尿病モデルラットを用い、AMPデアミナーゼ活性亢進により惹起されるATPレベルの低下が糖尿病性心筋症の拡張能機能障害に寄与することを見出した。本研究では2型糖尿病におけるAMPデアミナーゼ活性亢進の機序を検討、解明し、その制御を糖尿病性心筋症治療に結びつけることを目標とする。 肥満2型糖尿病モデルラットであるOLETFを用い、左室内圧-容積曲線を解析したところ、25-30週齢の時点では左室内圧-容積曲線を用いた解析により、左室収縮 能は維持されているが、後負荷増加により顕在化する左室拡張障害が存在することが示された。次にエネルギー産生・代謝障害の関与について左室心筋を用いた メタボローム解析により検討した。 アデノシン、ATPおよびアデニンヌクレオチドプールのレベルが低下しIMPが増加していた。この変化はOLETFで観察されたAMPデアミナーゼ (AMPD)の活性亢進によるものと考えられた。ATPレベルはTauおよびLVEDPいずれとも良好な負の相関を示したため、AMPD活性上昇に起因するATPレベルの低下 は、選択的に拡張機能障害を惹起する可能性がある。これらの成績から、糖尿病心筋で観察されるAMPD活性亢進が糖尿病性心筋症の治療標的となる可能性が考えられ、その活性調節機構の解析を開始した。これまでの検討により、2型糖尿病心筋で観察されるmicro RNA301bの発現低下によるAMPD3遺伝子発現抑制の関与を示すデータを得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
AMPDの活性調整に関与する因子として、microRNA array解析を行い、OLETFで発現レベルが低下 (<50%) するmicroRNA (miRNA) を21個同定し、AMPD3mRNAの3'UTRと結合する可能性のあるmiRNAを予測アルゴリズムを用いて絞り込んだ。それらのmiRNAのインヒビターを心筋細胞にトランスフェクションしてAMPD3蛋白量の変化を検討することにより、最終的にmiR-301bの発現低下が糖尿病心においてAMPD3蛋白の発現増加に寄与することを同定した。その他の蛋白発現制御因子はこれまでの検討により、その関与の可能性が除外されており、今後の研究の進行の方向性が定まったため概ね順調に進展していると判断している。すなわち、(1) アロステリック調節による活性制御の検討では、抗AMPD3抗体による免疫沈降物を用いた二次元電気泳動法により2 型糖尿病でAMPD3と 相互作用が増加する蛋白をTOF/MSを用いて網羅的に解析し、いくつかの結合蛋白を同定したが、その結合が糖尿病で増加するものは観察されず、蛋白との相互作 用の修飾がAMPD3活性や細胞内局在に影響を及ぼす可能性は否定的であった。(2) 翻訳後修飾によるAMPD3活性への影響の検討では、AMPD活性に影響を及ぼすことが報告されている複数のリン酸化部位のリン酸化レベルの変化も観察されなかった。(3) 蛋白発現レベルの調整に関してもユビキチン-プロテアソーム系による AMPD3蛋白分解は、糖尿病でむしろ亢進していること、mRNAの発現に関しては糖尿病と非糖尿病で差異が観察されないことを確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、AMPD3を標的とした介入を糖尿病性心筋症の治療に応用するために、以下の検討を計画している。
(1) AMPD3の発現亢進にmiR-301bの発現低下が寄与することを見出したため、まず単離心筋細胞でmiR-301b inihibitor, miR-301b mimicをトランスフェクションし、AMPD3の蛋白 発現レベル、ATPレベルが修飾されるかを確認する。さらに、in vivoでのmiR-301b mimicの導入がOLETFの拡張機能障害を改善するかを圧-容積曲線を用いた解析を行い検討す る。
(2) AMPD3の細胞内局在の検討: SERCA2aによる細胞質Ca2+の小胞体 (SR) へのATP依存性の取込みが能動的左室拡張の主要な機序であることに着目し、SR分画の AMPD3レべルを定量する。AMPD3は重要な生理機能も有するため、非選択的な抑制は有害事象を惹起し得るが、SR近傍のAMPD3活性を選択的に抑制できれば左室拡張機能障害のみを特異的に改善することができる可能性がある。そこで、SR分画局在促進/維持に寄与する分子機序を検討する。免疫沈降法、二次元電気泳動、TOF/MSによ る解析でAMPD3との結合蛋白がSR分画に同定されれば、その結合部位の相補ペプチドを作成する。相補ペプチドを導入してAMPD3のSR分画への移行を抑制すること により拡張機能障害が改善されるかを検討する。
(3) ハイスループットによる網羅的な化合物の解析でAMPD3を選択的に阻害する分子(compound X)が報告されている。これを報告した研究室にcompound Xの提供を依頼し、得られた場合はcompound XをOLETFに投与することによる拡張機能への影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
他の現在進行しているプロジェクトと抗体や消耗品を共有することが可能であった。さらに、一部プロトコールが重複し、先行して進行している他のプロジェクトでおこなった、予備実験結果を参照することができたため、実験条件を設定するための予備実験量が当初の予測よりも少なく済んだ。したがって、実験自体は 当初の予定どおり進行し、データが蓄積しつつあるにも関わらず、今年度の予算に対して余剰額が生じ、次年度使用額が生じた。しかし、平成30年度以降は、他のプロジェクトと実験内容に相違が生じるため、消耗品の共有も限定され、当初の予定通りの出費が予想される。各種試薬、抗体に加えて、8月に予定されてい るヨーロッパ心臓病学会での発表の際の旅費として、一部の助成金を使用したい。
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] Translational regulation by miR-301b upregulates AMP deaminase in diabetic hearts.2018
Author(s)
Tatekoshi Y, Tanno M, Kouzu H, Abe K, Miki T, Kuno A, Yano T, Ishikawa S, Ohwada W, Sato T, Niinuma T, Suzuki H, Miura T.
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Journal Title
J Mol Cell Cardiol
Volume: 119
Pages: 138-146
DOI
Peer Reviewed
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