2017 Fiscal Year Research-status Report
大動脈瘤に対するマクロファージを標的とした新規診断法と治療法の探索的研究
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17K09593
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
宮田 昌明 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 客員研究員 (00347113)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 義之 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00573023)
赤崎 雄一 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (00631920)
大石 充 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (50335345)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 大動脈瘤 / マクロファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、スタンフォード大学のDalman教授とXu博士との共同研究により、アンジオテンシンIIの1a型受容体ノックアウトマウス（AT1aKO）と野生型マウスの大動脈内にporcine pancreatic elastase (PPE)を注入して腹部大動脈瘤モデルを作成して比較したところ、AT1aKOでは野生型に比べ、大動脈瘤形成が抑制されること明らかにした。さらに、野生型マウスにアンジオテンシン受容体拮抗薬であるテルミサルタンを投与によりPPARγやT細胞分化を介さずPPE誘発性大動脈瘤形成を抑制することを見出し報告した（J Vasc Surg. 2018, 67: 573-584）。
次に、大動脈瘤モデルマウスの発症、進展、退縮における全マクロファージの役割の検討を行った。CD-11b-diphtheria toxin receptor (CD11b-DTR)トランスジェニックマウスにdiphtheria toxin（DT）を投与することにより全マクロファージを死滅させることが可能である。CD11b-DTRトランスジェニックマウスにPPE処置の3日前からｇ体重あたり10ngのdiphtheria toxin（DT）を1日おきに投与し、PPE処置後3日目までの投与により大動脈瘤の発症、13日目までの投与により大動脈瘤の進展、PPE処置の4日目から13日目までの投与により大動脈瘤の退縮に対する全マクロファージ抑制の効果を検討した。コントロールにはC57BL6マウスを用い、PPE処置を行い、PPE処置の3日前からｇ体重あたり10ngのDTを13日目まで投与した。PPE処置後0、３、７、14日目に超音波にて腹部大動脈瘤径を計測し、14日目には大動脈を摘出して組織解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スタンフォード大学のDalman教授とXu博士と以前から共同研究を行っており、PPE誘発性大動脈瘤マウスモデルにおいて、アンジオテンシンII受容体が大動脈瘤形成に関与し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン投与により、大動脈瘤形成を抑制できることを明らかにして論文報告した。さらに、CD11b-DTRトランスジェニックマウスにDTを投与する実験系で大動脈瘤モデルマウスの発症、進展、退縮における全マクロファージの役割に関する実験を行い、現在、超音波データ、免疫組織染色、さらに、組織片をelastaseとcollagenaseで処理し血球を抽出しフローサイトメトリーでCD45を発現する白血球成分と活性化マクロファージのマーカーである葉酸レセプターβ（FRβ）を発現する活性化マクロファージ成分の比率を解析しており、順調に動物実験は進行している。
大動脈瘤手術患者における活性化マクロファージの役割の検討に関しては、血中可溶性FRβ濃度を測定や免疫組織染色に用いるために、FRβモノクローナル抗体を作成している。
また、Webによる鹿児島県大動脈瘤患者レジストリーに関しては、調査項目など確定させ、Web登録のための独自のサーバーを準備し、Webによるレジストリーシステムを構築した。現在、10例の登録があり、これも順調に研究が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
大動脈瘤モデルマウスの発症、進展、退縮における全マクロファージの役割の検討に関しては、実験データの解析を進める。
次は、大動脈瘤モデルマウスの発症、進展、退縮における活性化マクロファージの役割に関する動物実験を進める。10～12週齢のオスのアポ蛋白E欠損（apoE-KO）マウスの腎動脈以下の腹部大動脈を一時的に結紮して1.5単位/mlのPPEを30μl注入し、5分後に結紮を解除して大動脈瘤モデルを作成する。活性化マクロファージを抑制するためにｇ体重あたり100ngのFRβイムノトキシンをPPE処置の１日後から2日おきに投与し、PPE処置後3日目までは大動脈瘤の発症、13日目までは大動脈瘤の進展に対する効果を検討できる。さらに、PPE処置の4日目から13日目までFRβイムノトキシンを投与し、FRβイムノトキシンによる活性化マクロファージの抑制により大動脈瘤を退縮できるか検討する。コントロールはC57BL6マウスにPPE処置を行い、PPE処置の１日後からｇ体重あたり100ngのFRβイムノトキシンを13日目まで投与する。トキシンのみを投与する対照群も作成する。超音波による経時的大動脈瘤径の計測と14日目の摘出大動脈瘤の組織解析を行う。
大動脈瘤手術患者における活性化マクロファージの役割の検討に関しては、ELISAシステムを構築して、血中可溶性FRβ濃度を測定し、さらに、大動脈瘤手術患者の摘出大動脈において、このFRβモノクロールにより免疫組織染色を行い、FRβを発現する活性化マクロファージの局在を検討する予定である。
また、Webによる鹿児島県大動脈瘤患者レジストリーに関しては、現在、10例の登録があるが、さらに登録数を増やして、その患者群の血清可溶性FRβや炎症マーカーを測定し、大動脈瘤進展、退縮あるいは心血管イベントや死亡との関連を検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究に関しては、スタンフォード大学との共同研究が多く、当方の支払いが少なくて済んだが、今後は鹿児島大学で行う実験が多くなるために翌年度の助成金とあわせて以下のように使用する計画である。
本研究には抗FRβモノクローナル抗体を多量に使用するために、マウス抗FRβモノクローナル抗体作成に必要な培養関連試薬、ヌードマウスの購入、蛋白精製に必要な試薬を購入する。さらに、抗FRβモノクローナル抗体に緑膿菌毒素を結合させたFRβイムノトキシンの作成に関する試薬、マウスや患者の大動脈瘤の組織を用いた免疫組織化学染色に用いる抗体や試薬、ならびに、フローサイトメトリー解析に必要な抗体や試薬、大動脈瘤患者の可溶性FRβ測定に必要なELISA作成キットとそれに使用する試薬を購入する。同時に測定する高感度CRP、IL-6などの測定に必要なキットや試薬も購入する。
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