肺腺がんの微小乳頭状構造のオルガノイド培養システムの確立

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09614
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 永野 達也 神戸大学, 医学研究科, 助教 (80624684)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 善博 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (20291453) ; 立原 素子 神戸大学, 医学研究科, 助教 (40448626) ; 田村 大介 神戸大学, 医学部附属病院, 非常勤講師 (80646597)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 微小乳頭状構造 / スパイラルアレイ / オルガノイド培養

Outline of Annual Research Achievements

非小細胞肺がんにおける微小乳頭状構造（micropapillary component, MPC）の存在は予後不良因子として知られているが、その詳細な発生メカニズムは解明されておらず、また、MPCの確立された培養システムがないことが細胞株の樹立への大きな障害となっている。この研究では、細胞-基質間接着分子に着目してMPCの形成機構を明らかにすること、更にはMPCのオルガノイド培養システムを確立し、MPCの細胞株を樹立することが主な目的である。本研究によりがんの浸潤・転移機構に関する新たな知見が得られること、更に、3次元培養システムや樹立された細胞株を利用することにより、がん研究が大きく推進し、新規作用機序に基づく治療法の開発が進んで行くことも期待される。
当該年度はMPCを有する肺がん症例と、MPCを有さない肺がん症例のそれぞれの既存のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックから、表層を厚さ50～100 µmで薄切し、切片を巻いてレシピエントブロックへ垂直に再包埋しアレイブロックを作製した（スパイラルアレイ）。ここで、スパイラルアレイは、従来の組織アレイと比較し広い範囲の組織をカバーすることができ、免疫染色において対象となる染色性を有する部位がより確実に描出されるというメリットがある。The Cancer Genome Atlas (TCGA) からいくつかの候補分子を選び、免疫染色を行い、染色性の違いによって予後や再発率に有意な相違をもたらす予後予測因子、再発予測因子をそれぞれ同定することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では理化学研究所の呼吸器形成研究チーム、森本充チームリーダー、当研究機関に属する呼吸器外科学分野の眞庭謙昌教授、さらには病理診断学分野の酒井康裕講師に協力を頂きながら、当該年度までの目標であったスパイラルアレイブロックの作成と、オルガノイド培養の実験系の確立に成功しているため。

Strategy for Future Research Activity

前年度に引き続きMPCの細胞株の樹立に取り組んでおり、MPCの細胞株をオルガノイド培養し、MPCが発生していく様子を経時的に観察する。MPCのオルガノイド培養は、MPCの初代培養細胞をマトリジェルと共にプレートに撒き、既報のオルガノイド培養システムを基に行っていく（Jung P. et al. Nat Med. 2011;17:1225-7、Dye BR. et al. Elife. 2015;4. doi: 10.7554/eLife.05098）。即ち、幹細胞分化抑制に重要な骨形成タンパク質（BMP）阻害タンパク質であるNoggin、アクチビンシグナル阻害剤のSB431542、WNTシグナルの活性化剤のCHIR99021、ヘッジホッグシグナルの活性化剤のSAGを添加することでオルガノイドを作製する。既に、A549などの肺胞上皮細胞由来の肺がん細胞株を用いてシステムの立ち上げ、条件検討に取り組んでおり、MPCの初代培養細胞を使用してもオルガノイド培養が可能であるとの感触を掴んでいる。さらに、非MPCの細胞株を用いて、細胞-基質間接着分子の発現をsiRNAでノックダウンし、非MPCの細胞株がMPCの細胞株に変化するかを3D-imagingにて解析する。