2017 Fiscal Year Research-status Report
MAPKシグナルを介するケモカイン抑制による免疫療法抵抗性の解明と克服法の開発
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17K09652
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
住本 秀敏 滋賀医科大学, 医学部, 特任講師 (00306838)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺本 晃治 滋賀医科大学, 医学部, 特任講師 (10452244)
醍醐 弥太郎 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (30345029)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | MAPKシグナル / EGFRシグナル / 肺癌 / ケモカイン / Tリンパ球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H29年度はヒト肺癌細胞株を用いたMAPKシグナルとケモカイン産生の関連に焦点を当てて解析した。まず、TCGAデーターベースを参照し、肺癌腫瘍組織内CD8a、CD4と発現が相関するケモカイン及びケモカイン受容体を検索したところ、CCL3, CCL4, CCL5,CXCL9, CXCL10,CXCL16及びそれらに対応する受容体のmRNA発現の相関が高い事ことから、これらのケモカインが腫瘍内へのTリンパ球浸潤に関連していると推察した。次にヒト肺癌細胞株をMEK阻害剤で処理したところ複数の細胞株で阻害剤処理によりCXCL10 ,CCL5の発現上昇が誘導されたことからMAPKシグナルがこれらのケモカイン発現抑制に関連していることが示唆された。
一方、TCGAデータベース上でCD8aの発現がEGFR遺伝子変異陽性群で陰性群より有意に低く、上記ケモカインの発現も有意に低下していることを見出し、EGFRシグナルの下流でこれらのケモカイン産生が抑制される結果、CD8+ Tリンパ球の腫瘍内浸潤が抑制される可能性を考えた。そこでEGFR変異陽性肺癌細胞株を用いて、EGFR阻害剤処理による培養上清中のケモカインの変動をMultiplex chemokine arrayで測定したところ阻害剤処理により複数のケモカイン産生の上昇を認め、特にIFN-γ応答遺伝子であるCXCL9, 10, 11はIFN-γ処理により強く上昇した。また、EGFR下流でケモカイン産生抑制に関連するシグナルを調べる目的でMEK阻害剤、PI3K阻害剤、STAT3阻害剤処理がケモカインCXCL10産生に与える影響をEGFR阻害剤処理と比較したところ、MEK阻害剤のみがCXCL10産生を誘導したがEGFR阻害剤処理に比べると弱く、MAPKシグナルがEGFR下流でケモカイン産生抑制に部分的に関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
「MAPKシグナルがケモカイン産生抑制シグナルである」という当初の仮説に基づき、まずMAPKシグナルを安定的に抑制する細胞株を作製し、仮説の検証を行ったが、レンチウイルスベクターを用いたshRNA発現ベクターによるERK1,2の同時抑制ではMEK阻害剤のデータ再現は得られず、ウイルス感染に伴う非特異的影響がベースラインのケモカイン産生を誘導してMAPKシグナル阻害の効果が見えにくくなった可能性が考えられたため、実験系の再考を余儀なくされた。
また、前記TCGAのデータに基づき、肺癌組織内T細胞浸潤に関与が疑われる6種類のケモカインに焦点を当てて、14肺癌細胞株でMEK阻害剤の影響をスクリーニングしたところ、mRNA発現上昇の最も強いケモカインはCXCL10であったが、MAPKシグナル依存性のCXCL10抑制は肺癌の一部で認められるものであることが判明したため、当初の仮説に修正が必要と思われた。
一方、TCGAデータでEGFR変異肺癌細胞でCD8+ TIL及びケモカインの減少が見られたことから、EGFRシグナルとケモカインの産生に注目して研究を進めているが、EGFRシグナル下流でケモカイン抑制に最も寄与しているシグナルはMAPKシグナルであることを示唆するデータを得ており、今後はEGFR-MAPKシグナルとケモカインの産生抑制に焦点を当てて研究を継続するべく方針を変更した。
以上のように当初の仮説及び方法論の問題点から研究の方向性に若干の修正を来したことが研究遅延の理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
EGFR変異肺癌細胞株で、ケモカインの産生がEGFRシグナル依存性に抑制を受ける分子機構についてさらに詳細な検討を加える。予備的な検討からはMAPKシグナルの関与が示唆されており、MAPKシグナルによるケモカイン抑制との関連を進める。また、Multiplex chemokine arrayの結果から特にIFN-γシグナル依存性のケモカイン（CXCL9,10,11）の産生がEGFRシグナルにより強く抑制されていたことから、EGFRシグナルがIFN-γ経路の抑制に関連している可能性を想定し、RNA-seqを用いた網羅的mRNA発現解析によりEGFRシグナルが関連するIFN-γ経路および・または他のシグナル経路につきケモカイン産生抑制との関連を検索する。さらに、CXCL10遺伝子プロモーター領域のクローニングに既に成功しており、今後転写レベルの発現制御機構を検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
H30年度の科研費交付が決定するまでの期間に必要な物品費（試薬等）の購入費用として次年度使用額を確保した。
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