2018 Fiscal Year Research-status Report
アスパラギン残基の脱アミド化反応による慢性閉塞性肺疾患発症のメカニズムの解明
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17K09658
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
小笠原 正人 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (00325367)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀬戸口 靖弘 東京医科大学, 医学部, 兼任教授 (90206649)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | mitochondria / アスパラギン酸残基 / 脱アミド / 脂肪滴 / 加齢 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Prohibitin 1(PHB1)蛋白質は主にミトコンドリアに局在し、Asn-Gly又はAsn-Serからなるアミノ酸配列が2か所（N24, N226）存在する。Asn残基は加齢などで非酵素的翻訳後修飾によりAsp残基に変化しやすい。そこで我々はPHB1（WT）、N24D、およびN226D変異を導入したPHB1を発現するA549細胞株を作成しその特徴を評価するため脂肪滴の大きさ（oil red 染色で検討）、脂肪滴形成関連分子の遺伝子発現、ミトコンドリアの形態（電子顕微鏡で検討）、さらに細胞の増殖能を評価するためwound healing assayを行い検討した。脂肪滴の大きさはPHB1(WT),N24D、N226D変異PHB1発現細胞では1ミクロン以下の脂肪滴が減少し、一方１．５ミクロン以上の脂肪滴が増加しており、癒合型脂肪滴の増加が確認された。脂肪滴形成関連分子perilipin1~3は増加する一方、perilipin4~6は低下し、脂肪滴形成、分泌の流れに影響していることが確認された。Wound healing assayではN24D発現細胞で細胞増殖能の低下を認め、増殖因子の1つであるEGFRの発現を白レベルで検討した結果、コントロ－ルと比較しPHB1（WT）、PHB1(N226D)ではEGFRの増加を認めたが、PHB1(N24D)では～５０％まで低下し、細胞増殖能低下の原因の1つである可能性が推測された。さらに我々は、PHB1(N24D)の特異的機能を基に、N24D変異を認識するモノクロ－ナル抗体をラットで作成し、PHB1の発現に対するPHB1(N24D)の発現を検討した。16週齢のマウス肺と比較し65週齢のマウス肺では2倍以上発現上昇を認め、加齢とともにPHB1の翻訳後修飾が起こっていることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PHB1(N24D)を認識するモノクロ－ナル抗体の作成は出来、抗体の評価も行い、おおむね順調であるが、加齢促進マウス及びCOPD病態モデルでの検討が残っている。またヒト検体を用いた検討では若年層のコントロ－ル、高齢者と慢性閉塞性肺疾患患者の末梢血でのPHB1(N24D)発現の検討を行う必要があるが検体が十分集まっていない。また肺がん（COPD（－））症例と肺がん（COPD（＋））症例の検体も集まっていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
加齢促進マウス、COPD病態モデルでPHB1の変化、脂肪滴の大きさ、遺伝子発現を検討し、肺の加齢現象とPHB1翻訳後修飾の関係を明確にする。臨床検体は肺組織に関しては集まりにくいので、末梢血を用い、単球でのPHB1（N24D）の発現を検討する。COPD(+)喫煙者群、COPD(+)非喫煙者群、COPD(-)高齢者群、COPD(-)若年者群に分けて検討する。臨床研究に関する共同研究者である瀬戸口靖弘は東京医科大学から東京医科歯科大学特任教授へ転出したので東京医科歯科大学の倫理委員会の承認を経て行う。動物実験は岩手医科大学動物実験委員会の承認を経て動物を購入し実験を行う。動物組織の標本の作製は岩手医科大学病理学教室で行う。
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| Causes of Carryover |
動物実験を予定していたが、次年度の金額と合わせと動物購入することとしたので本年度は残額として残った。また、抗体作成に費用が幾分安くできたため。
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