microRNAによる新しいCOPD治療を目指した気道分泌型エクソソーム解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09668
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 佐藤 匡 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10596993)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 瀬山 邦明 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (10226681) ; 高橋 史行 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70327823)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 慢性閉塞性肺疾患(COPD) / 気道上皮細胞 / 小気道上皮細胞 / タバコ煙抽出液 / COX-2 / エクソソーム

Outline of Annual Research Achievements

昨年度、ヒト小気道上皮細胞（small airway epithelial cells; SAEC）、正常ヒト気管支上皮細胞（normal human bronchial epithelial cells; NHBE）それぞれにタバコ煙抽出液 （CSE）刺激を行い、SAECでTNF signaling pathwayといった炎症関連のパスウェイがNHBEと比較して有意に亢進していた。さらに、TNF signaling pathwayに含まれ、特にSAECでCSEにより誘導される遺伝子としてCOX-2が抽出され、これが、CSE曝露により、NHBEと比較してより早期から有意に発現亢進することを確認した。今年度、短期間のタバコ煙曝露を行ったマウス肺を用いた免疫組織染色によりCOX-2がタバコ煙曝露により末梢気道において中枢気道よりも有意に発現することも確認した。末梢および中枢の気道上皮細胞のタバコ煙曝露に対する反応性の違いについてin vitro, in vivoの両面から詳細に解析することができ、一連の成果を英文論文として報告することができた(Baskoro H, et al. BMC Pulm Med, 2018; 18:148)。次いで、SAECおよびNHBEをサブコンフルエントまで培養した後、2.5%CSEにて24時間刺激を行った。細胞上清を約50 mL回収し、超遠心法によりエクソソームを画分した。採取したエクソソームを解析したところ、直径100 nm前後の粒子のエクソソームの存在が確認できた。両細胞においてCSEの有無によってエクソソーム分泌量に変化はみられなかった。また、エクソソーム分画でのCD81およびCD9の発現も、CSEの有無による変化は観察されなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、末梢および中枢の気道上皮細胞のタバコ煙曝露に対する反応性の違いについてin vitro, in vivoの両面から詳細に解析することができ、一連の成果を英文論文として報告するという目標を達成することができた。気道上皮細胞の培養上清からの超遠心法を用いたエクソソーム分離法を確立することはできていたが、SAECおよびNHBE細胞由来のエクソソームについては詳細な解析は今後の課題となっている。エクソソーム解析およびその評価について、専門家から指導いただける体制を構築しており比較的順調に行うことができている。タバコ煙曝露装置SG-300については、製造元である柴田科学との連携により、定期的なメンテナンスを実施することができ、実験が計画的に進捗することができた。以上の理由から本研究は概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

末梢気道を起点とすると考えられるタバコ煙曝露に伴う炎症が肺全体へ波及するメカニズムを検討する目的に、末梢気道および中枢気道由来のエクソソームを引き続き解析する。解析に十分なエクソソームを得るには多くの細胞が必要であることから、新たなロットの細胞を大量に培養することで、解析に十分なエクソソーム由来RNAの回収を試みる。それぞれの細胞での遺伝子発現プロファイルの違いを検討し、さらにmiRとターゲット遺伝子の統合解析を行い、抽出されたmiRの機能的な分析を試みる。COPD患者由来細胞でのプロファイルの違いについても解析する。

Causes of Carryover

前年度の未使用額分があり、今年度としては予定使用額に近い金額の支出となっている。その他の項目については、マイクロアレイ解析について、精度を担保する意味合いから実績のある業者への委託解析を行ったことによる支出額となっている。次年度については、実験助手雇用のための人件費および実験消耗品費、2019年4月に東京で開催される日本呼吸器学会学術講演会の参加費等への使用を予定している。

Research Products

• [Journal Article] Regional heterogeneity in response of airway epithelial cells to cigarette smoke (2018)
  • Author(s): Baskoro H, Sato T, Karasutani K, Suzuki Y, Mitsui A, Arano N, Nurwidya F, Kato M, Takahashi F, Kodama Y, Seyama K, Takahashi K
  • Journal Title: BMC Pulm Med Volume: 18 Pages: 148
  • DOI: 10.1186/s12890-018-0715-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Elimination of p19ARF-expressing cells protects against pulmonary emphysema in mice (2018)
  • Author(s): Mikawa R, Suzuki Y, Baskoro H, Kanayama K, Sugimoto K, Sato T, Sugimoto M
  • Journal Title: Aging Cell Volume: 17 Pages: e12827
  • DOI: 10.1111/acel.12827
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice (2018)
  • Author(s): Yohei Suzuki, Tadashi Sato, Masataka Sugimoto, Hario Baskoro, Keiko Karasutani, Aki Mitsui, Fariz Nurwidya, Naoko Arano, Yuzo Kodama, Shin-ichi Hirano, Akihito Ishigami, Kuniaki Seyama, Kazuhisa Takahashi
  • Organizer: 第58回日本呼吸器学会学術講演会