2017 Fiscal Year Research-status Report

Clarification of precondition causing direct reprogramming in lung cancer

Research Project

Project/Area Number	17K09676
Research Institution	Dokkyo Medical University
Principal Investigator	矢澤華子 (佐藤) 獨協医科大学, 医学部, 講師 (60438132)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	原由紀子東京医科大学, 医学部, 准教授 (40313267) 矢澤卓也獨協医科大学, 医学部, 教授 (50251054) 宮田千恵聖マリアンナ医科大学, 医学部, その他(移行) (20613847) [Withdrawn]
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	肺癌 / ダイレクトリプログラミング / 神経内分泌腫瘍 / POU3F4 / POU4F2
Outline of Annual Research Achievements	申請者らはこれまで、単独遺伝子導入により非小細胞癌細胞を小細胞癌細胞に形質転換させることに成功し、その形質転換が細胞運命の直接転換(ダイレクトリプログラミング)現象により惹起されること、ダイレクトリプログラミング現象を惹起可能な肺癌細胞は未分化な肺癌由来の細胞に限定されることを明らかにしてきた。そこで本研究では、肺癌細胞においてダイレクトリプログラミング現象が惹起されうる条件について検討することを目的とし、その条件をRB1の不活化を中心に解析を行うため、はじめに種々の組織型に由来する肺癌細胞株におけるRB1の発現状態および機能異常の有無について解析した。その結果、小細胞癌株においてはRB1のタンパクレベルでの発現が殆どないのに対し、非小細胞癌株では検出可能なレベルのRB1発現が認められ、RB1の機能異常についてCCDN1/CDKN2A比により検討すると、小細胞癌株ではRB1が機能していないこと、非小細胞癌株においては発現しているRB1が正常に機能していることが明らかになった。このことからRB1遺伝子が有する機能は、非小細胞癌株においてRB1遺伝子をノックアウトすることにより、正確に検索出来ることが確認された。そこで、肺腺癌３株を用い、CRISPR-Cas9法によるRB1遺伝子のノックアウトを試み、各腺癌株につき複数のクローンの株化に成功した。樹立されたRB1ノックアウト株を用い、上皮間葉転換に関わる分子の発現変化について検索したところ、複数分子において発現亢進が認められた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 多種の組織型に由来する多数の肺癌培養株を用い、RB1の発現状態、機能状態について解析が終了し、複数の非小細胞肺癌株に由来するRB1遺伝子ノックアウト株の樹立に成功し、またRB1発現欠如に伴う上皮間葉転換に関わる遺伝子発現亢進現象を明らかにすることにより、今後行われる解析の基盤を整えることができたため。
Strategy for Future Research Activity	作成された複数のRB1遺伝子ノックアウト株を用い、RB1発現状態の変化に伴う細胞形態の変化について、SCIDマウス皮下に形成させた腫瘍組織を用いて病理組織学的、免疫組織化学的に解析する。これまでの報告によれば、癌細胞はRB1遺伝子発現消失に伴い未分化となり幼若化するものと思われるため、胎児性抗原やstemnessに関与する分子、上皮間葉転換に伴い発現変動する分子の発現に注目して検討する。また作成された複数のRB1遺伝子ノックアウト株を用い、POU3F4あるいはPOU4F2遺伝子を強制発現させ、ダイレクトリプログラミング現象が惹起されるか否かについて検討を行っていく。
Causes of Carryover	残額が少額となったため。残額を含め、分子病理学的・免疫組織化学的解析に用いる。