2019 Fiscal Year Annual Research Report
Role of novel transcription cofactor C14orf43 in the molecular mechanism of MR-sensitive hypertension
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17K09734
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
横田 健一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (50424156)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | アルドステロン / MR / ミネラルコルチコイド受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
MRは核内受容体に属する蛋白であり、アルドステロン依存性にENaCやSGK1などの標的遺伝子の発現を促進し、腎遠位尿細管においてナトリウムの再吸収を通じ血圧を上昇させる機能を持つ。しかしながら、MR活性化に関わる分子メカニズムは未だ詳細が不明のままである。我々はFLAGタグ付きMR安定発現HEK293細胞を樹立し、その細胞から核抽出液を取得し、FLAG抗体によるアフィニティ精製を行い、LC-MS/MSによる同定を行うことで、C14orf43という機能未知因子をMR相互作用因子候補として同定した。そこでマウス腎臓組織の免疫染色を通じてMRとの共局在を確認するとともに、ｑPCR法でアルドステロン依存性のMR標的遺伝子の定量化測定を行い、C14orf43がMRの新規co-repressorであることを示す結果を得た。またC14orf43のMR転写抑制機能をさらに詳細に検討するために、C14orf43と相互作用する蛋白質の網羅的同定を、安定発現細胞株の樹立→大量培養→FLAG抗体による精製→LS-MS/MSを用いた方法でより精度を高めて試みたところHDAC1やHDAC2、RPD3、SENP3、TdIF1、CHD4、RBBP4、MTA2、MBD4などのエピゲノム制御因子蛋白を同定できた。以上の結果からC14orf43がヒストン脱アセチル化やユビキチン化、DNAメチル化などを介してMRの転写を負に制御していることが考えられた。C14orf43ノックアウトマウスの作成については、従来からのアプローチによるキメラマウスからのC14orf43 floxマウスの作出は困難であったため、ゲノム編集技術を用いて作出を試みた。exon2にcrRNAを設計し、マウス体外受精卵にゲノム編集因子を導入し、受精卵を偽妊娠マウスに移植した。その結果得られたマウスはいずれもキメラマウスであることが証明された。
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