2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K09745
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
菅野 直人 東北大学, 大学病院, 助教 (30509550)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | αシヌクレイン / ヒストン修飾 / 神経分化 / 免疫沈降 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
αシヌクレインがヒストン修飾に与える影響を調べる手がかりとして、まずαシヌクレインが核内において相互作用を持つタンパクのスクリーニングを行った。具体的には培養細胞であるHEK293細胞を用い、HAタグを付加したαシヌクレインを恒常的に発現する細胞株を樹立。次いで、本細胞を大量に培養後に細胞分画を行い核分画を得た。この核分画においてEZviewビーズを用いてHAタグタンパクを回収、ついで精製。産物を非αシヌクレイン発現細胞における精製物と共にSDS-PAGEで分離、銀染色でバンドパターンの違いを確認。その上で、nanoLC-MS/MSによる網羅解析を行った。コントロールに比べSpC 5倍以上であるものを有意としたところ103の核内タンパクが同定された。そのうち転写調整に関与するものを選択し、ウェスタンブロットにおいてαシヌクレインとのinteractionを確認したところ7つに絞り込まれ、極めて興味深いことにそれらの一部は共通の経路に存在し、その中核となるのは神経発生において重要な役割を果たすある複合体であった。本複合体は神経発生の過程において、その構成タンパクに変化が生じることが知られている。構成タンパクそれぞれのタンパクに対する免疫沈降によって複合体の構成を検討したところ、αシヌクレインを神経細胞分化過程で強発現させると、複合体の構成変化が抑制されることが明らかとなった。また、この複合体にはヒストン修飾に関わる酵素が結合する事を明らかにした。同一条件下の細胞から、ヒストンのみを抽出。得られたヒストンの修飾パターンを解析したところ、αシヌクレイン存在下ではその酵素が特異的に調整するヒストン修飾に変化が観察されることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
核においてαシヌクレインと結合するタンパクを網羅解析したところ、複数の候補が挙がり、さらにそれらをwetの実験で裏付けることができた。αシヌクレインと結合するタンパクにはヒストン修飾因子/転写因子が含まれており、当初の予定通り本因子を鍵としてクロマチン免疫沈降へと検討を進めることができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
複合体に結合するヒストン修飾酵素と、実際に観察されたヒストン修飾の関わりをより深く検討していく。具体的には、修飾酵素の活生変化をマイクロプレートベースを用いin vitroベースで検討する。最終的には、変化がもたらされたヒストン修飾によって影響を受ける遺伝子転写をクロマチン免疫沈降法を駆使し解明して行く予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度に次世代シーケンサーによるクロマチン免疫沈降産物の受託解析が必要となり、1,000,000円程度のまとまった支出（解析費）を要するため。
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