2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K09745
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
菅野 直人 東北大学, 大学病院, 助教 (30509550)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | αシヌクレイン / ヒストン修飾 / 神経分化 / 免疫沈降 / クロマチン免疫沈降 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
αシヌクレイン核内における役割を調べる手がかりとして、まずαシヌクレインが核内において相互作用を持つタンパクのスクリーニングを行った。具体的には培養細胞であるHEK293細胞を用い、HAタグを付加したαシヌクレインを恒常的に発現する細胞株を樹立。次いで、本細胞の大量培養後に細胞分画を行い核分画を得た。この核分画においてEZviewビーズを用いてHAタグタンパクを回収、ついで精製。産物を非αシヌクレイン発現細胞における精製物と共にSDS-PAGEで分離、銀染色でバンドパターンの違いを確認。その上で、nanoLC-MS/MSによる網羅解析を行った。コントロールに比べSpC 5倍以上であるものを有意としたところ103の核内タンパクが同定された。そのうち転写調整に関与するものを選択し、ウェスタンブロットにおいてαシヌクレインとのinteractionを確認した。確認されたタンパクの一部は、極めて興味深いことに共通の経路に存在していた。その経路は神経発生において重要な役割を果たすある複合体と、そこに付随するヒストン修飾酵素であった。本複合体は神経発生の過程において、その構成タンパクに変化が生じることが知られている。構成タンパクそれぞれのタンパクに対する免疫沈降によって複合体の構成を検討したところ、αシヌクレインを神経細胞分化過程で強発現させると、複合体の構成変化が抑制されることが明らかとなった。
さらに、先述のヒストン修飾酵素によって特異的に変化するヒストン修飾は、αシヌクレインの存在下で有意に変化がみられた。本ヒストン修飾によって発現変化がもたらされうる遺伝子を同定するために、特異的抗体を用いたクロマチン免疫沈降を試みた。得られたサンプルを次世代シーケンサー解析し、現在マッピングを行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本実験で研究対象としているヒストン修飾抗体を用いたクロマチン免疫沈降はこれまであまり報告がなく、また、通常の細胞においてゲノム中に本ヒストン修飾を持つ割合が高くないためか、クロマチン免疫沈降の条件設定は極めて難しく多くの時間と労力を費やしたが年度内には次世代シーケンサー解析まで持っていくことができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本実験系で変化のみられたヒストン修飾に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降後の次世代シーケンサー解析が終了した。今後は、標的となった遺伝子の絞り込みをin silico、さらにクロマチン免疫沈降からの定量PCRで確認していく予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度に次世代シーケンサーによるクロマチン免疫沈降産物の委託解析（マッピング等）に500,000円程度のまとまった支出（解析費）を要するため。
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