2017 Fiscal Year Research-status Report
ジペプチドリピート蛋白による核内小体の異常に着目した運動神経細胞死の解明
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17K09749
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
横関 明男 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (90515719)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ALS / GGGGCC / ジペプチドリピート / stable cell |
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は，運動神経が脱落する致死性疾患である．ALSでは，神経細胞内に核内蛋白であるTDP-43が，細胞質内に封入体を形成する点が大きな特徴である．現在のALS研究は，TDP-43の機能の点から解析が進められているが，病態は依然不明な点が多い．一方，ALSでは，遺伝子異常による家族性ALSが存在する．第9染色体上のC9ORF72遺伝子のGGGGCC配列の異常伸長が家族性ALS(c9ALS)の原因であり，欧米では最も頻度の高い家族性ALSである．同遺伝子変異例の病理は，孤発性ALSと同様にTDP-43の封入体を形成するため，ｃ9ALSの解析は，孤発性ALSの病態解明につながる可能性がある．
GGGGCCの繰り返し配列は，non-ATG dependent translationによりglycine-prorin(GP),glycine-alanine(GA),glycine-arginine(GR)のdipeptideの反復配列に翻訳される．そこで，本研究では最初にGGGGCC30リピートで，GP,GA,GRのdipeptideをHEK293細胞に一過性発現させた．すると，GAとGPはGFP(green fluorescent protein)単独で発現させたように細胞全体にdiffuseに局在したが，GRは核内に局在した．そのため，今後の研究はGRのdipeptide repeatsを使用して研究を進めることとした．次に，100リピートをHEK293細胞に一過性発現させると，30リピートで確認できた核ないの局在は消失し，細胞質のみの局在となった．一方，核細胞ごとdipeptide repeatsの発現量に差があり，研究結果の再現性が不安定であった．そのため，Flip-In systemを用いて，ドキシサイクリンで誘導可能な安定発現細胞の作成を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実施計画の段階では，GGGGCCリピート伸長の発現ベクターを，各種培養細胞に一過性発現させ，解析を実施する予定であったが，一過性発現では，細胞ごとの発現にかなり偏りがあることがわかり，安定発現細胞の作成が必要と判断し，研究計画段階に想定していなかった安定発現細胞の作成を実施したため，予定より研究が遅れている．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度に作成したglycine-arginine dipeptide repeatsを安定発現するHEK29細胞を使用して，Cajal小体を始めとする核内小体の挙動の変化を免疫染色，western blottingを用いて解析を行う．Cajal小体の挙動に大きな変化が見いだせない場合は，ALSのdisease proteinであるTDP-43は，Cajal小体以外にもSMN(survival motor neuron)小体，PML(promyelocytic leukemia)小体とも局在することが報告されていることから，これらの核内小体の挙動も確認する予定である．
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| Causes of Carryover |
平成29年度は，GGGGCCリピートを培養細胞に発現させて，核内小体の解析を行う予定であったが，GGGGCCリピートの一過性発現では細胞により発現量の差異が生じることが明らかとなったため，やむを得ずGGGGCCリピートの安定発現細胞作成を行った．この安定発現細胞作成で平成29年度は時間を費やしたため，当初予定していた核内小体の解析での予算執行が行われなかったため，平成29度予算の未執行分を平成30年度に繰越を行うこととした．この未執行分は，核内小体の解析のために執行予定である．
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