アルツハイマー病のタウ伝播と軸索変性でのグリアの役割解明とグリアを標的とした治療

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09757
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 浅井 宏英 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (50510210)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 浩雄 九州大学, 大学病院, 特任講師 (00701830) ; 山崎 亮 九州大学, 医学研究院, 准教授 (10467946)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: アルツハイマー病 / ミクログリア / CD33

Outline of Annual Research Achievements

研究に用いるADモデルマウスであるAPP-KIマウスのcharacterizationを中心に行った。APP-KI ADモデルマウスにおいては、Iba1による免染結果からコントロールマウス(B6)と比較してミクログリアが活性化していることを確かめられた。また、APP-KIマウスにおいてはresidentミクログリアのマーカーであるP2RY12も強発現しており、主にresidentミクログリアが活性化していることが明らかとなった。さらに、これらミクログリアの活性化は、毒性ターンアミロイドプラーク周囲に認められ、オリゴマーを貪食していることが考えられた。免染結果からCD33は特にアミロイドプラーク周囲に発現しており、ミクログリアがアミロイド蛋白を貪食すると、CD33が強発現し、貪食に抑制がかかることが予想された。ADにおいて、CD33はアミロイド蛋白のクリアランスにかかわっており、その病態に関わっている確認できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究で使用するADモデルマウスのcharacterizationはほぼ終了し、in vivoの培養実験どの準備も併行して行ってきた。学内における動物実験計画書の承認に時間を要したことや、研究棟の改修工事により、年度初め、年度の終わりに2度の引越し作業を余儀なくされたことで、実際の実験予定よりもやや進行は遅れている。

Strategy for Future Research Activity

ウイルスベクター、定位脳手術は設備、技術的にすぐに実施することは難しく、まずはベクター、定位脳手術を用いずに以下の培養細胞実験でアミロイドβによるexsomeを介したタウの凝集、リン酸化が生じるか検討する。
出生直後の野生型B6（P0） のprimary microgliaを培養し、siRNA(short interfering RNA)でCD33をsilencing（CD33KD）させた後に、APP-KIの胎生16日齢（E16）の　primary neuronと共培養を行う。そして共培養したあとprimary microgliaを回収し、ATPでexosomeを放出させ、超遠心（100,000g）で回収し、wild typeのE16のprimary neuronに負荷を行う。
B6 microglia 由来のリポゾームにはAPPが大量に貪食されていると予想され、WBで実際に細胞内に取り込まれていることを確認する。成熟型 IL-1βの産生とともに、プロ型 IL-1βの産生を誘導する転写因子である nuclear factor-κB(NF-κB)の活性化やプロ型 IL-1βの成熟型への変換に必要なカスパーゼ-1 の活性化なども生化学的な手法で評価する。
exosome負荷された 野生型primary B6 neuronでは大量のタウのリン酸化が認められると予想される。ニューロン内リン酸化はAT8やPHFタウ抗体による細胞免疫染色やドットブロットやHTRFを用いた生化学的定量により行う。
また、このexosomeには多量の炎症惹起性microRNAを含有している可能性もあり、マイクロアレイ解析を行う。

Causes of Carryover

動物実験計画書の承認に時間を要したことや、研究棟の改修工事により、年度初め、年度の終わりに2度の引越し作業を余儀なくされたことで、実際の実験予定よりもやや進行は遅れている。