2018 Fiscal Year Research-status Report
RNA代謝異常を指標にしたALSバイオマーカーの確立
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17K09766
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岡野 ジェイムス洋尚 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90338020)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ALS / TDP-43 / 選択的スプライシング / RNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ALSの早期診断を可能にするために、ALSモデルマウスおよびヒト細胞を駆使してRNA代謝異常を指標としたバイオマーカーの確立を目指している。初年度の研究計画で、変異型ヒトTDP-43遺伝子ノックインマウスにおいてTDP-43の変異によりその機能不全を強く示唆する知見が得られたため、２年目はヒト細胞におけるTDP-43の標的であるRNAの選択的スプライシングパターンの解析を行った。具体的には、ヒト培養細胞（複数の神経系および非神経系細胞株）に野生型もしくは変異型TDP-43を強制発現、また逆に内因性TDP-43のノックダウンにより異常スプライシングパターンを呈するRNAを検索した。また、TDP-43の発現レベルが自己調節されていることが報告されていることから、TDP-43のプロモータを同定し、変異型TDP-43の自己プロモータに対する影響を調べることにより、TDP-43の発現レベル自体がバイオマーカーとして使えないか検討した。その結果、野生型TDP-43は自己プロモータに対して発現量制御的に働くが、変異型TDP-43は自己制御を免れることが明らかになった。
さらにヒト運動ニューロンにおけるバイオマーカーを検索するため、ヒトiPS細胞から運動ニューロンを高効率に分化誘導する方法を確立するとともに、組み換えウイルスによりiPS細胞由来神経幹細胞に遺伝子導入する方法を確立した。また、正常ヒトiPS細胞においてゲノム編集技術によりTDP-43遺伝子に点変異を導入する手法を確立し、遺伝子変異を有するiPS細胞の作成を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
３０年度はヒト細胞においてバイオマーカーとなりうる因子を同定し、その動態を検討した。HEK293細胞・SH-SY5Y細胞に野生型もしくは変異型TDP-43を強制発現、内因性TDP-43のノックダウンにより異常スプライシングパターンを呈するRNAを検索した。内因性に発現するTDP-43標的RNA:PDP1およびBCL2L11では、野生型TDP-43の強制発現による選択的エクソンのスプライシングパターンが、対照群と比較して有意に変化しており、逆に内因性TDP-43のノックダウンでは強制発現とは逆の方向にパターンがシフトしていた。さらにノックダウン実験では、対照群では検出されないGPSM2およびATG4Bのcryptic exonが検出され、極めてSN比の高いTDP-43機能アッセイを構築することができた。同検出法を用いて種々の変異型TDP-43の機能の検討を開始した。正常ヒトiPS細胞201B7を理研より取得し、運動ニューロンへの分化誘導法を確立した。分化誘導は、高い分化誘導効率を得るために慈恵医大基盤研究施設が開発したアデノウイルスを用いた遺伝子導入法を利用した。その結果、６０％以上の細胞がMAP2陽性・SMI32陽性・ChAT陽性の運動ニューロンであった。さらに組み換えレンチウイルスにより神経幹細胞の段階で遺伝子導入する手法を確立した事により、変異型TDP-43を高発現する運動ニューロンを作成し解析する方法の確立に成功し、３１年度に開始するヒトiPS細胞由来運動ニューロンを用いたALS研究につなげることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず正常ヒトiPS細胞を用いた解析を行う。組み換えレンチウイルスにより神経幹細胞の段階で遺伝子導入をし、野生型もしくは変異型TDP-43を高発現する運動ニューロンを作成し解析する。誘導された運動ニューロンからRNAを抽出し、定量的PCR法により標的RNAのスプライシングパターン、cryptic exonの存在を指標に解析を行う。次に正常ヒトiPS細胞においてゲノム編集技術によりTDP-43遺伝子にA382T変異を導入する。すでにiPS細胞における遺伝子変異導入技術は確立しており、得られたiPS細胞株についてバイオマーカー候補RNAの発現量・スプライシングパターンを検査し、正常ヒトiPS細胞のそれと比較検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、マウスを用いた研究成果が予測よりも少数の動物個体で達成することができたからである。３１年度の研究計画では、ヒトiPS細胞を培養し分化誘導を行って解析するために高価な細胞培養試薬・遺伝子発現解析試薬を多数使用する必要がある。そのため、次年度使用額と３１年度請求額を合わせた金額を主に物品費に計上し、これらの試薬を購入する計画である。
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[Journal Article] Loss of DDHD2, whose mutation causes spastic paraplegia, promotes reactive oxygen species generation and apoptosis.2018
Author(s)
Maruyama T, Baba T, Maemoto Y, Hara-Miyauchi C, Hasegawa-Ogawa M, Okano HJ, Enda Y, Matsumoto K, Arimitsu N, Nakao K, Hamamoto H, Sekimizu K, Ohto-Nakanishi T, Nakanishi H, Tokuyama T, Yanagi S, Tagaya M, Tani K.
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Journal Title
Cell Death and Disease
Volume: 9
Pages: 797
DOI
Peer Reviewed / Open Access
