2019 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of RNA-based Biomarkers for ALS
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17K09766
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岡野 ジェイムス洋尚 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90338020)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ALS / TDP-43 / 選択的スプライシング / RNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ALSの早期診断を可能にするために、ALSモデルマウスおよびヒト細胞を駆使してRNA代謝異常を指標としたバイオマーカーを探索した。3年目は同定したTDP-43のプロモータをも用いてTDP-43の発現量が転写レベルで自己調節されていることを示した。野生型TDP-43は自己プロモータに対して抑制的に働くことを示したが、家族性ALSの原因として報告された変異型TDP-43は自己制御を免れることがわかった。さらにCHIPアッセイによりTDP-43がTDP-43のプロモータ領域に結合することを明らかにした。また、TDP-43プロモータ領域の中で転写活性に必須の配列を同定し、この領域にDNA/RNA結合タンパク質であるhnRNPKが結合することを発見した。CHIPアッセイによりhnRNPKが同プロモータ領域に結合することを明らかにした。これらの結果からTDP-43プロモータの転写活性の測定が、TDP-43の機能レベルをモニターするマーカーとなり得ることが示唆された。
一方、TDP-43のノックダウンにより複数のcryptic exon（偽エクソン）が選択される遺伝子（GPSM2、ATG4B、PFKP)の解析を行った。cryptic exonの出現はTDP-43の活性と反比例することが示され、TDP-43の機能低下をモニターする極めて鋭敏なバイオマーカーとなりうることがわかった。変異型TDP-43の強制発現によってはGPSM2 cryptic exonは選択されなかった。
さらにヒト運動ニューロンにおけるバイオマーカーを検索するため、ヒトiPS細胞から運動ニューロンを高効率に分化誘導する方法を確立するとともに、組み換えウイルスによりiPS細胞由来神経幹細胞に遺伝子導入する方法を確立した。さらに、正常ヒトiPS細胞においてゲノム編集技術によりTDP-43遺伝子に点変異を導入し、遺伝子変異を有するiPS細胞の作成に成功した。この成果により変異TDP-43遺伝子を有すiPS細胞株由来運動ニューロンを用いたRNA次世代シークエンス解析の準備が整った。
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