2017 Fiscal Year Research-status Report
GDP型Rab27a変換機構の解明とインスリン分泌後のエンドサイトーシス
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17K09838
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
木村 俊秀 大分大学, 医学部, 准教授 (60404373)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 糖尿病 / インスリン / 膵B細胞 / シグナル伝達 / プロテオーム / タンパク質 / 低分子量Gタンパク質 / Rab27a |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではRab27aをGDP型に変換するEPI64に着目し、その新たな結合パートナーであるGαの結合特性や役割を解析することでエンドサイトーシスの開始シグナルの解明を目指す。エンドサイトーシスは、インスリン分泌の量とタイミングを決めるために必須であり、その破綻は2型糖尿病の新たな原因となりうる。しかし、これまでの研究ではインスリンを放出するまでの過程を扱い、その後のステップを扱った研究は皆無である。本研究は、申請者が同定したGDP型Rab27aシグナルを解析することで、開口放出後のエンドサイトーシスシグナルの解明を行う。
本年度は、EPI64とGαの結合を生化学的に解析した。まず、Gαの特異的抗体とリコンビナントタンパク質を作製した。次に、免疫沈降実験と精製タンパク質を用いた結合実験より、GαとEPI64が細胞内で複合体を形成すること、その結合が直接で特異的であることを明らかにした。次に、EPI64のフラグメントを作製し、Gα結合ドメインを同定した。さらに、同定した結合部位をもとにドミナントネガティブ/アクティブ変異体の作製を行った。また、マウス膵切片を免疫染色し、EPI64とGαが膵B細胞で共発現していることを明らかにした。
以上の結果より、EPI64とGαの結合様式が明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うGαによるEPI64の活性制御機構を理解する上で極めて重要であると共に、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、EPI64とその結合タンパク質であるGαが、インスリン顆粒膜のエンドサイトーシスを制御する分子メカニズムを、以下に従って解明する予定である。
平成29年度：EPI64とGαの結合様式を解析する。
平成30年度：GαによるEPI64の活性制御機構を解析する。
平成31年度：Gαの上流シグナルを解析する。
本年度は、EPI64とGαの結合様式を生化学的な手法により明らかにした。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、前年度の成果を基盤にGαによるEPI64の活性制御機構を検討する。
1. Gαには、2つのシグナル経路が備わっている。GTP型に変換されたGαと、Gαの変換によって解離し活性を示すGβγである。そこで、どちらの分子がEPI64の活性を制御しているのかを調べる。
2. 申請者は、Gαの発現を抑制した細胞では、EPI64の活性化に必要なPIP3が産生されないことを既に見出している。そこで、グルコースによるエンドサイトーシスに関与するPI3キナーゼの同定を試みる。
3. PI3キナーゼの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡で解析する。さらに、Gαのノックダウンや過剰発現、Gβγ阻害剤がPI3キナーゼの細胞内動態に及ぼす影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
Gαのリコンビナントタンパク質は、当初想定していたバキュロウイルスを用いた昆虫細胞からではなく、大腸菌より精製した。そのため、次年度使用額が生じた。当該研究費は、翌年度以降の研究費と共に、Gαの各種変異体の作製にあてる予定である。平成30年度は、前年度の成果を基盤にGαによるEPI64の活性制御機構を検討する。
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Research Products
(4 results)
