膵β細胞特異的・時期 誘導性オートファジー不全モデルマウスの作製とその機能解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09849
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 小宮 幸次 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50385077)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 綿田 裕孝 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60343480) ; 宮塚 健 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60622363)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 膵β細胞 / インスリン分泌 / オートファジー

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病はインスリンの絶対的あるいは相対的分泌不全による慢性の高血糖が様々な合併症を引き起こす代謝疾患である。我々は唯一のインスリン産生細胞である膵β細胞の恒常性維持にオートファジー機構が重要な役割を担うことを明らかにしてきたがオートファジー不全と膵β細胞不全とを繋ぐ分子メカニズムの詳細は未解明である。
そこで本研究では、オートファジー機能維持に不可欠な遺伝子Atg7を膵β細胞特異的かつ誘導性にAtg7を欠失させる遺伝子改変マウス（MIP-CreER; Atg7[flox/flox]マウス: iβAtg7KOマウス）を作製した。6週齢のiβAtg7KOマウスおよび対照同胞マウスにタモキシフェン(TM)投与後、8週齢で膵島を単離し、抗Atg7抗体, 抗LC3抗体を用いたWestern blottingを行ったところ、2週間のオートファジー不全下において、Atg7は約80%低下し、オートファジーフラックスの一つの指標であるLC3 type1 からtype2への転換は抑制された。以上の結果は、iβAtg7KOマウスでは我々の期待通りにβ細胞特異的かつ時期誘導性にオートファジー不全が誘導されることを示している。
次に、2週間Atg7を欠失させた群(iβAtg7KO-2w群)と6週間 Atg7を欠失させた群(iβAtg7KO-6w群)の2群の膵島を単離し、トランスクリプトーム解析を行った。iβAtg7KO-6wマウスの膵島では対照マウスに比し、インスリン合成や分泌に関わるβ細胞特異的遺伝子の発現が低下していたのに対して、iβAtg7KO-2wマウスの膵島ではこれらの遺伝子の発現は維持されていた。一方、Atg7KO-2w群・Atg7KO-6w群間で共通して発現が増加あるいは低下している数個の遺伝子を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

iβAtg7KOマウスにおいて設計図通りオートファジー不全が誘導されていることを複数の実験系において確認した。短期（2週間）および長期（６週間）のオートファジー不全マウス、および対照マウスの膵島を単離し、RNA sequencingを予定通り行った。現在、上記in vivo実験により抽出したオートファジー不全感受性遺伝子が、in vitro実験系においてもオートファジー不全下で誘導されるか確認するための実験系を構築している。

Strategy for Future Research Activity

RNA sequencingで抽出された遺伝子について、iβAtg7KO マウス単離膵島における遺伝子発現の変化をRT-PCRで確認する。またiβAtg7KO マウスの膵切片を作成し、in situ hybridizationもしくは免疫染色を用いて、抽出された遺伝子群の発現変化を確認する。
さらに、現在構築中のin vitro実験系を用いて、抽出された遺伝子群の発現変化をWestern blot、RT-PCR、免疫細胞染色により解析する。