2017 Fiscal Year Research-status Report
癌抑制遺伝子MEN1の非腫瘍組織（骨格筋）における新規機能の解明
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17K09873
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
小澤 厚志 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10573496)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 内分泌学 / 内分泌腫瘍 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多発性内分泌腫瘍症１型（MEN１型）の原因遺伝子であるMEN1は、癌抑制遺伝子と考えられているが、その翻訳蛋白meninの詳細な機能は不明である。私達はMEN1型のモデルマウスであるMen1ヘテロ接合体マウス（Men1+/-）を解析していく過程で、Men1+/-マウスが膵内分泌腫瘍を発症する前段階においては野生型マウスに比較して、耐糖能が変容している可能性を見出したため、癌抑制遺伝子MEN1の非腫瘍組織（骨格筋）における機能に着目して研究を進めた。Men1+/-および対照群として野生型マウス (WT)を用いた。
（１）１８週齢までのマウスから膵組織とヒラメ筋、長指伸筋を摘出し病理解析を施行したところ、膵組織においては一部にラ氏島細胞の異形成を認めた。骨格筋には明らかな差異を認めなかった。（２）膵組織、筋組織からRNAおよび蛋白質を抽出し、Men1遺伝子およびmeninの発現量を、それぞれリアルタイムPCR法、ウェスタンブロット法を用いて検討した。Men1+/-ではMen1遺伝子、meninとも発現量が低下していた。（３）１２週から１８週齢までのMen1+/-とWTマウスを用いて、グルコース負荷試験、インスリン負荷試験を施行したが、週齢によって耐糖能に差異を認めた。（４）コラゲネース法を用いてマウスからラ氏島細胞を抽出し、グルコース、KCLによるインスリン分泌刺激実験を施行した。低濃度グルコース刺激におけるインスリン分泌能には、２群間で有意差は認めなかった。（５）１５週齢のMen1+/-とWTから摘出したラ氏島細胞、ヒラメ筋、長指伸筋よりRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイ解析に提出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度の研究として、１）Men1+/-とWTの筋組織におけるMen1遺伝子発現量、menin蛋白発現量の解析、２）Men1+/-とWTマウスから膵ラ氏島細胞を単離してのEx-vivoでのインスリン分泌刺激試験、３）Men1+/-とWTマウスにインスリン負荷後に骨格筋組織を単離してのインスリン受容体下流のシグナル伝達の解析、４）同骨格筋を用いてのcDNAマイクロアレイ解析、を計画していた。上記４つのうち、３）以外に関しては予定通りに施行できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初、我々が想定していた骨格筋におけるmeninの機能とは異なる機能を示唆する実験結果が出てきた。そのためまず骨格筋由来のRNAを用いてのcDNAマイクロアレイ解析の結果を得た上で、Men1+/-とWTの骨格筋において発現量が大きく異なる遺伝子（群）を同定することとした。また平成３０年度の当初の計画通りにC2C12筋芽細胞株を用いて、筋芽細胞を骨格筋細胞に分化させる過程で、meninをノックダウンして、骨格筋組織の組織形成ならびに糖取り込みにおけるmeninの作用を確認する。これらの研究結果をもとに必要に応じて、再度Men1+/-とWTにおける耐糖能の評価をin-vivoにて検討する。
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| Causes of Carryover |
理由：平成２9年度の研究計画の一つとして当初、ノックアウトマウス及び野生型マウスの下大静脈からインスリンを注入後に、骨格筋を摘出し、液体窒素で凍結保存後に、蛋白質およびRNA を抽出して、リアルタイムPCR法および各種抗体を用いてインスリン受容体下流シグナルの解析を施行する予定だったが、平成２９年度中の施行には至らなかったため、次年度使用額が生じた。
使用計画：
単離した骨格筋を用いてのインスリン受容体下流シグナル因子群の解析のための実験の諸費用ならびにリアルタイムPCR法のためのプローブ代金、抗体代金に使用する。またC2C12筋芽細胞株を用いてmeninをノックダウンしてインスリン受容体下流シグナルを解析する費用にも使用する。
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