2017 Fiscal Year Research-status Report
エピゲノム情報を基にしたヒト造血幹細胞の自己複製機構の解明を目指した研究
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17K09899
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
高山 直也 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (10584229)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒト造血幹細胞 / エピゲノム解析 / CTCF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、これまで得られた、高純化した造血幹細胞を含むヒト血液細胞集団の網羅的なエピゲノム解析(オープンクロマチン解析、DNAメチル化解析)の結果をもとに、造血幹細胞増幅に関わる因子の探索を推進している。造血幹細胞と他の前駆細胞集団を差別化する因子として、CTCFを見出し、shRNA法を用いた遺伝子ノックダウン実験から、現在までにCTCFが、ヒト造血幹細胞特異的な分化開始点を制御していることを見出している。本研究では、①CTCFはどのように幹細胞特異的な静止期脱出機構を制御しているのか、 ②エピゲノム解析から得られているCTCF以外に同定されている他の候補遺伝子は、自己複製に関与するのか？を明らかにすることを目的としている。H29年度は、以下を行った。
A) HSCのCTCF遺伝子抑制を行い、その後に生じる遺伝子変化をRNA sequenceにより網羅的に解析し、CTCFのターゲット因子の候補を得た。
B) エピゲノム解析から得られているCTCF以外に同定されている他の候補遺伝子の内、Aで行ったCTCFの下流遺伝子候補の中で一致した遺伝子を優先して、shRNA法による遺伝子ノックダウン実験を行った。
C) 計３遺伝子の改変を行なったが、造血幹細胞の分化開始点を制御している因子は現段階では見出されていない。一方、さらに下流の成熟血液細胞分化課程で変化を示した遺伝子については、現在再現実験を行なっている最中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CTCF抑制後の遺伝子発現解析は順調に進み、候補遺伝子に対する遺伝子改変ベクターを順次作成している。
H29年度は、３つの候補遺伝子の遺伝子抑制ベクターを作成し、機能解析を行なったが、今の所明確なCTCFの下流遺伝子の同定には至っていない。
候補遺伝子が３つしか評価できなかった点について；
遺伝子抑制はshRNA法により行なっている。他の細胞株を使った実験の情報に、shRNAのシークエンスを決定していたが、他の細胞株と比較し、圧倒的にヒト造血幹細胞は遺伝子抑制が困難であり、それぞれの遺伝子に対して、十分な遺伝子抑制が得られるシークエンス選びに時間がかかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. CTCFの下流で働く、ヒト造血幹細胞分化を制御する因子の同定はできていないが、さらに下流での成熟細胞分化に関わる可能性がある因子については、さらに複数の臍帯血由来の血液細胞を用いて実験を行い、再現性を確認する。
2. その他の候補遺伝子についても引き続き、順次候補遺伝子のスクリーニングを進める。
3. 実験が遅れている原因である、“ヒト造血幹細胞は遺伝子抑制効率が悪く、それぞれの遺伝子に対して、十分な遺伝子抑制が得られるシークエンス選びに時間がかかる”ことについては、同時に複数のベクターを作成し、細胞株ではなく、ダイレクトにヒト造血幹・前駆細胞で評価することで、時間の短縮を行う。また、shRNA法以外の遺伝子改変法（Crisper-Cas9などによる遺伝子ノックアウト）も考慮する。
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