iPS細胞由来巨核球細胞および疾患特異的M蛋白を用いたPOEMS症候群の病態解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09901
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 武内 正博 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (50466702)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: POEMS症候群 / 巨核球 / 免疫グロブリン

Outline of Annual Research Achievements

POEMS症候群患者および多発性骨髄腫患者の骨髄中の形質細胞をSingle cell sortingした上で、cDNAライブラリー作成を行った。その結果、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の配列が相同な複数の細胞が検出され、特にPOEMS症候群患者においては既報の特定の軽鎖が認められた事から、POEMS症候群の腫瘍クローン由来の配列と推定し、重鎖および軽鎖のクローニングを行った。その後、腫瘍クローン由来の重鎖および軽鎖を元に２９３T細胞内で抗体の産生を行い、その精製を行った。精製された抗体と各種細胞株を用い、フローサイトメトリーやウェスタンブロッティング法で抗体の認識する抗原のスクリーニングを行い、抗体が認識する候補蛋白として蛋白質Aを同定した。その作用や意義については不明である。
また、imMKCLによる血小板産生については、共同研究者と連携し、feeder freeの方法を用いて血小板産生を行うことに成功した。その後、Anagrelideによる血小板産生抑制がどのように起きているかを確認するためにアポトーシスの有無、細胞周期の解析やRNA sequenceを行った。Anagrelideの投与を行うことでimMKCLにおいても血小板産生抑制が起こることを明らかにし、既報でAnagrelideによって発現が低下するとされるPF4などの遺伝子発現は低下していることが確認でき、また、アポトーシスは誘導しないこと、細胞周期に関連する遺伝子群の発現を変化させていることを確認できた。POEMS症候群に関連した遺伝子の一つであるVEGFの発現に関してはAnagrelideの投与前後で変化を認めなかったが、定常状態での評価であったことから病的にVEGFの産生亢進を起こしている状況での検討については今後条件検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

POEMS患者の骨髄中の形質細胞をSingle cell sortingし、cDNAライブラリーを作成する部分が技術的に最も困難と考えられたが、この1年の間にこの点をクリアーし、抗体産生ならびに標的候補の蛋白質の同定まで行うことが出来ている。
また、imMKCLによる血小板産生も当初は実験系が不安定であり血小板産生が確認できない状態が続いたが、細胞培養の試薬などを連携研究者と協議しながら調整する事で実験系を安定させることができ、Anagrelideによる作用機序を明らかにすることが出来た。Anagrelideによる血小板産生抑制機構については2018年12月の米国血液学会総会にて発表を行い、また、現在Haematologicaに投稿中である。

Strategy for Future Research Activity

POEMS症候群に関連した遺伝子の一つであるVEGFの発現に関してはAnagrelideの投与前後で変化を認めなかったが、定常状態での評価であったことから病的にVEGFの産生亢進を起こしている状況での検討については今後条件検討を行う予定である。

Causes of Carryover

実験試薬に要する予算が他に確保できたため。次年度の学会発表の際に旅費として使用する予定

Research Products

• [Presentation] Anagrelide Inhibits Proliferation and Platelet Generation in Immortalized Megakaryocyte Progenitor Cell Lines Established from Human Induced Pluripotent Stem Cells (2018)
  • Author(s): Koji Takaishi, Masahiro Takeuchi, Shokichi Tsukamoto, Naoya Takayama, Motohiko Oshima, Yusuke Isshiki, Kensuke Kayamori, Naoya Mimura, Chikako Ohwada, Tohru Iseki, Sou Nakamura, Koji Eto, Atsushi Iwama, Koutaro Yokote, Chiaki Nakaseko and Emiko Sakaida
  • Organizer: 2018 American Society of Hematology Annual Meeting