2017 Fiscal Year Research-status Report

Induction of hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells by inflammatory cytokines

Research Project

Project/Area Number	17K09911
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	北島健二公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主席研究員 (10346132)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ES細胞 / 造血幹細胞 / インターフェロン
Outline of Annual Research Achievements	われわれは、マウス胚性幹細胞 (Embryonic Stem Cells; ESCs) から血液細胞への試験管内分化誘導において、インターフェロン-γ (IFN-γ) により、Lineage 陰性 Sca-1 陽性 c-Kit 陽性 (LSK) 血液細胞が顕著に増加することを発見した。マウス胎仔において、IFN-γは、造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cells;HSCs) 発生に重要な分子である。そこで、IFN-γを用いたマウス ESCs から HSCs への新規分化誘導システムの開発に挑んでいる。マウスESCsをOP9ストロマ細胞と共培養すると、造血性血管内皮細胞（Hemogenic Endothelial Cells; HECs）に分化する。このHECsをIL-6・SCF・IFN-γ存在下でOP9細胞と共培養して得られたLSK細胞の長期骨髄再建能を調べるために、半致死量放射線照射した免疫不全マウス（NSG-CD45.1マウス）に移植した。しかしながら、移植後1ヶ月の時点での生着は、認められなかった。次に、ESCs由来のHECs（Tie-2陽性c-Kit陽性CD45陰性）は、IFN-γ存在下で培養すると、Sca-1を発現することを見出した。造血幹細胞が発生するAGM領域では、Sca-1陽性CD34陽性HECsから造血幹細胞が発生するとされている。一方、ESCsを6日間OP9細胞と共培養して得られるHECsは、CD34陰性が大部分であった。以上の結果から、AGM領域のHECsとESCs由来のHECsは、少なくともCD34の発現が異なっており、ESCsからは、AGM領域のHECsとは異なるHECsが誘導されている可能性が高いものと思われた。そこで、現在、ESCsからCD34陽性HECsを分化誘導する手段の開発を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason IFN-γにより誘導されたLSK細胞をマウスに移植しても、生着しなかった。そこで、現在の培養条件を改良する必要が出てきた。また、マウス胎仔AGM領域のHECsは、CD34陽性であるが、マウスESCsをOP9細胞と6日間共培養して得られたHECsは、CD34陰性が大部分（90%）であり、CD34陽性細胞は僅か（10%程度）であった。そこで、マウスESCsからCD34陽性のHECsを分化誘導するための培養条件の改良も必要となり、予定された研究計画が若干遅れている。
Strategy for Future Research Activity	マウス胎仔AGM領域のHECsからHSCsへの分化は、恒常的活性化型Aktを強制発現させたAGM領域由来の血管内皮細胞と共培養を行うと、顕著に促進されることがわかっている。また、AGM領域では、Sca-1陽性のHECsからHSCsが発生する。マウスESC由来のHECsも、IFN-γによりSca-1陽性となることが判明している。そこで、このマウスESC由来のSca-1陽性HECsを、恒常的活性化型Aktを強制発現させたAGM領域由来の血管内皮細胞と共培養し、得られる血液細胞の解析を行う。また、予備的成果であるが、マウスESCsをOP9細胞と9日間共培養すると、CD34陽性のHECsが多く認められることが判明した。そこで、今後は、このCD34陽性HECsが、IFN-γによりSca-1陽性になるのか否か、および、AGM領域由来の血管内皮細胞との共培養により、HECsを分化誘導できるのか否か、の解析を計画している。
Causes of Carryover	当初、繰り返し行う予定であったマウス移植実験を、一回目のマウス移植実験の不成功により見合わせたため、次年度使用額が生じた。この補助金は、次年度、ストロマ細胞の検討などを行った後に、マウス移植実験のために使用する予定である。