2017 Fiscal Year Research-status Report
CEBPA遺伝子3’UTRメチル化を伴うMyeloid-T白血病の分子基盤の解明
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17K09929
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
岩永 栄作 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (90743675)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Myeloid-T白血病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CEBPA 3’UTRのエンハンサー活性が評価できる細胞株は知られていない。そこで、複数のミエロイド抗原、T細胞抗原を共発現する細胞株を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、ヒト細胞株レベルでCEBPA 3’UTRのエンハンサー活性が評価可能な細胞株を同定した。CEBPA 3’UTRの3’側から欠失させ、最終的に229bpのコアエンハンサー領域を同定した。配列モチーフ解析により、ある転写因子の結合配列が二か所、このエンハンサーに含まれていることを見出した。この転写因子結合配列に変異導入したプラスミドではレポーター活性は消失した。またマウスの既存のATAC-seqデータからもヒト3’UTRコアエンハンサー領域と相同領域にピークを認めこの領域がマウスでも保存され活性があることが推測された。ヒト細胞株でChIP-PCRを行い、対象転写因子が3'UTRコアエンハンサー領域に結合していることを証明した。
マウスMyeloid-T細胞株を用いてバイサルファイトシークエンスとATAC-seqを行った。3'UTRコアエンハンサー領域はメチル化されており、ATAC-seqでもピークは見られず、プライマリーMyeloid-T細胞やほかのマウス細胞株での検証が必要と考えられた。
3'UTRコアエンハンサー領域とcisおよびtransの相互作用を証明するため4C-seqの条件検討を行った。ヒト細胞株を用いて制限酵素とプライマーを設計し、次世代シークエンサーを用いて相互作用を検出した結果、有用なプライマーペアを見出した。複数のヒト細胞株を用いて固定方法や制限酵素処理の時間等を検討し再現性のあるプロトコールを確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
レポーターアッセイと配列解析で見出した転写因子がCEBPA3'UTRコアエンハンサーに結合していることをChIP-PCRで証明できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ChIP-seqを行いCEBPA3'UTRコアエンハンサーに該当転写因子が結合することを複数の細胞株で証明する。vivoでMyeloid-T progenitorを同定し正常Myeloid-Tの分化機構の解明およびMyeloid-T白血病の発症機序を解明するためCEBPA3'UTRコアエンハンサーを用いたレポータートランスジェニックマウスを作成する。
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| Causes of Carryover |
今年度は予定していた試薬等研究材料の購入が少なくて済み、解析依頼費用のその他経費が増加した。30年度に繰越した研究費は29年度に取得できた解析結果を基にさらに研究を進めるために使用する予定である。
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