SCIDに対する子宮内造血幹細胞移植治療のブタモデル

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09960
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 花園 豊 自治医科大学, 医学部, 教授 (70251246)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: X-SCID / ピッグ / 造血幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

重症複合免疫不全症（SCID）は、生まれつき免疫がなく、頻繁に感染症に罹患する。SCIDの中で最も多いX染色体連鎖SCID（X-SCID）は、IL2受容体γ鎖(IL2RG)遺伝子に変異があり、男子のみ発症する。我が国で年間数名～10名出生と推定される。生存には造血幹細胞移植が必須だが、多くのケースではドナーが見つからない(>75%)。本研究では、X-SCIDのピッグモデルを利用して、X-SCIDの出生前造血幹細胞治療を開発する。
しかし、X-SCIDピッグ胎仔に対する組織採取や移植は技術的に難しかった。ピッグ子宮構造上の問題や、ピッグが流産しやすいといったことが理由である。ピッグ胎仔の組織採取や移植ができなければ、X-SCIDの出生前診断も出生前治療も難しい。このことは研究計画段階で予想されていたことではある。交付申請書の研究計画で述べたとおり、出生直後の治療実験に変更となった。
2年目の３０年度は、出生１ヶ月後のX-SCIDピッグに対して、造血幹細胞の自家移植を実施した。ピッグの造血幹細胞は、骨髄有核細胞から各種分化マーカー陽性細胞を除去したものを用いた。こうして得られたX-SCIDピッグの造血幹細胞は、正常IL2RG遺伝子を発現できるように遺伝子改変した。遺伝子改変造血幹細胞をX-SCIDピッグの骨髄内に移植した。現在までに二頭のX-SCIDピッグに対して遺伝子改変造血幹細胞の自家移植実験を実施した。しかし、いずれも移植2～3ヶ月後、免疫系が再構築される前に感染症で死亡した。X-SCIDピッグ治療後の感染症対策が今後の課題となる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに我々は、X-SCIDピッグの作出（Watanabe M et al. PLOS ONE 2013）、繁殖（Matsunari H et al. PNAS 2018）、およびその３ヶ月以上にわたる長期飼育（Hara H et al. Exp Anim 2017）に成功した。さらに30年度は、X-SCIDピッグ造血幹細胞の自家移植実験を２頭に対して実施できた。この過程で、ピッグ骨髄細胞の採取、造血幹細胞の濃縮、移植、移植後管理等について、標準プロトコールがほぼ出来た。したがって、本研究はおおむね順調に進捗していると言える。しかし、ピッグ子宮の構造上の問題や、ピッグが流産しやすいといったことが理由で、X-SCIDの出生前治療は技術的に困難である。このことは研究計画段階で予想されていたことではある。交付申請書の研究計画で述べたとおり、出生直後（約１ヶ月）の移植実験に変更となった。

Strategy for Future Research Activity

死亡したX-SCIDピッグ２頭は、いずれも感染症による死亡だった。治療後の感染予防体制を確立したい。具体的には、無菌的飼育、抗生剤投与、水平感染予防などを検討する。
現在、ピッグ造血幹細胞は、ピッグ骨髄有核細胞から各種分化マーカー（Lin）陽性細胞を除去することで濃縮したものを実験に使用している。しかし、濃縮率は依然として不十分であり、大量の細胞を遺伝子改変する費用が問題となっている。Linマーカーの追加、またはLinマーカー以外にPositive selectionマーカー（例えばCD34）を追加することで、造血幹細胞の濃縮率をさらに高められないか検討する。
ヒトやマウスにおいて造血幹細胞の培養にはstem cell factor, thrombopoietin, Flt-3 ligand (SCF/TPO/FL)が必須とされている。しかしながら、ピッグと交差するTPOは市販されておらず、SCFやFLに関してはピッグと交差するものはあっても、ピッグへの移植細胞の培養に足る量の確保は困難である。そこで、これらのサイトカインを安定的に供給する体制を構築する。具体的には、これらのサイトカインを発現するcDNAをクローニングする。クローニングしたサイトカインcDNAを適当な細胞に強制発現させ、その培養上清をピッグ造血幹細胞の培養液に添加して使用する。

Causes of Carryover

本年度に計画された実験の一部は大学予算を充当できたので、その分が次年度使用額となった。次年度、X-SCIDピッグの飼育管理や採材に必要な消耗品、X-SCIDピッグの造血幹細胞の濃縮や培養に必要な器具・試薬の購入に充てる。

Research Products

• [Journal Article] Production and rearing germ-free X-SCID pigs (2018)
  • Author(s): Hara H, Shibata H, Nakano K, Abe T, Uosaki H, Ohnuki T, Hishikawa S, Kunita S, Watanabe M, Nureki O, Nagashima H, Hanazono Y
  • Journal Title: Experimental Animals Volume: 67 Pages: 139-146
  • DOI: 10.1538/expanim.17-0095
  • Peer Reviewed / Open Access