皮膚筋炎の新たな標的臓器である筋膜組織における網羅的遺伝子解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K09985
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 吉田 健 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (20398796)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 皮膚筋炎 / 筋膜 / 網羅的遺伝子解析

Outline of Annual Research Achievements

皮膚筋炎（dermatomyositis: DM）は，主に皮膚と骨格筋に炎症をきたし，ときには重篤な間質性肺炎を合併する原因不明の自己免疫性疾患であり，不幸な転帰を辿ることも少なくない．申請者は，①DM における炎症は筋膜で高率に起こり，②かつ，筋膜から始まり徐々に筋組織に進展する傾向があることを MRI と筋膜を含む筋生検(en bloc biopsy)によって示した．本研究は，多発性筋炎(polymyositis: PM)と比較してDMの筋膜に発現している遺伝子を網羅的に解析し，DMの病態に関連する発現遺伝子を明らかにすることを目的とする．
2017年度～2019年度は本研究に同意をされたDMとPM患者において，局所麻酔下にen bloc biopsy 法（既に現在進行している臨床研究で確立した方法である）で皮下組織，筋膜，筋肉を一塊に採取した．このMRI ガイド下による生検法ではサンプリングエラーがほとんどなく(5%未満)，得られた組織の一部をOCTコンパウンドに包埋し，凍結したブロックを－80℃で保存した。サンプルは目標数に達したため，まずは6例において凍結切片を作製し，HE染色情報を参考にして研究申請者の指示のもと受託業者によりマクロダイセクションによって筋膜組織と筋組織に分け，それぞれの組織からRNAを抽出した．本学のバイオアナライザーでRNAのクオリティーチェックをしたところLIN値7～9台と良質のRNAであることが確認できた．これらのRNAからRNA-seqライブラリーを作製した．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

サンプル収集がやや遅れていたため１年間延長申請し，目標症例数に達したため残りの研究は問題なく行えると考えられる．

Strategy for Future Research Activity

2019年度はパイロットスタディーとして6例のサンプルを使用した．それらのサンプルから抽出したRNAのクオリティーは良質なものであることが確認でき，RNA-seqも問題なく行えた．2020年度は追加で10例以上のサンプルから同様の方法でRNAを抽出し，RNA-seqを開始する．遺伝子の発現が高く，皮膚筋炎の病態に強く関与していることが予想される候補分子については免疫染色などで蛋白発現の局在を確認し，その細胞のフェノタイプを同定する予定である．

Causes of Carryover

サンプル収集を2017～2018年度までで完了する予定であったが，目標サンプル数に達しなかったため2019年度も引き続きサンプルの収集を行った．前述した方法で抽出したRNAのクオリティーは良質であることが確認でき，RNA-seq は問題なく行えることも確認できた．2020年度は追加サンプルのRNA 抽出とライブラリー作製，RNA-seq解析を行う．そして，病態に関連していることが予想される高発現遺伝子をピックアップし，その発現蛋白を同定するための免疫染色やin situハイブリダイゼーションを行う予定である．残りの研究費はこれらの実験の費用に充てる．