酸化鉄ナノ粒子を用いた粘膜免疫を標的とする新規肺炎球菌ワクチンの開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10013
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 石井 恵子 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (00291253)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肺炎球菌 / ナノ粒子ワクチン / 酸化鉄ナノ粒子 / 粘膜免疫

Outline of Annual Research Achievements

肺炎球菌は市中肺炎の主要な原因菌であり、髄膜炎などの重篤な侵襲性感染症を起こすことが知られる。肺炎球菌表層には多糖からなる厚い莢膜が存在することから、莢膜多糖がワクチン抗原として用いられる。多糖の血清型は90種以上存在するが、23種の多糖に対応するワクチンPPSV23と13種の多糖に対応する無毒化毒素結合型ワクチンPCV13が現行ワクチンとして使用されている。これらの効果は高く、ワクチンに含まれる血清型菌よる発症は急速に減少した。しかし一方で、ワクチンに含まれない血清型菌による発症が増加し、セロタイプリプレイスメントとして問題となっている。
本研究はこの問題を解決するため、血清型に影響されないユニバーサルワクチンの開発を目指す。具体的には、菌表面に存在し、強い抗原性を示すタンパク質Pneumococcal surface protein A (PspA)をユニバーサル抗原とし、マクロファージに貪食されやすいデキストランコート酸化鉄ナノ粒子（NP）をアジュバントとするワクチンを作製し、その機能を明らかにする。これまでに、リコンビナントPspA（rPspA）を大腸菌で発現させ、His-tagを利用して精製したのち、独自に開発した方法でNPに結合させることに成功した。今年度は、大腸菌由来のLipopolysaccharide (LPS)を効率よく除去する方法を導入することにより、PspA-NPワクチン（PspA-NP）の作製法を確立した。このPspA-NPをマウス気道内に投与し、肺胞洗浄液（BALF）中および血清中の各種抗体価を測定した。PspA-NPが粘膜免疫を誘導したことから、経鼻ワクチンとしての可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H29年度中にrPspAとNPの結合に成功していたが、大腸菌由来のLPSを除く過程でrPspAの回収量が極端に低いことが課題であった。H30年度は、triton-X114を用いるLPS除去法を取り入れることにより、高い回収率でrPspAを精製することができた。このLPS除去rPspAをNPと結合させてPspA-NPを作製し、マウス気道内への投与による抗体産生誘導を検討した。PspA-NP投与マウスでは肺胞洗浄液（BALF）中へのIgG1、IgA産生が観察され、その量はPspAを投与したものに比較して多かった。この結果から、PspA-NPの気道投与により粘膜免疫応答が誘導されること、一方でアレルギー反応は起こりにくいことが示唆され、PspA-NPの経鼻ワクチンとしての可能性が示された。血清中ではIgG1の強い誘導とIgG2aの弱い誘導が観察され、菌血症による侵襲性感染症の予防への可能性が示された。PspA-NPによる免疫応答がIgG1>IgG2aのTh2型であったため、強いTh1型免疫応答を誘導するCpGをPspA-NPに加えて投与し、影響を検討した。その結果、BALF中のIgG1とIgA量、および血清中のIgG2a量の増加が認められ、粘膜免疫における追加アジュバント効果と全身免疫におけるTh1型応答の誘導が確認された。

Strategy for Future Research Activity

最終年度の今年度は、①PspA-NPの肺炎球菌感染に対する防御効果、②PspA-NPの体内動態、および③PspA-NPによる免疫誘導機序を明らかにする。
①では、PspA-NPを経気道的に投与することで免疫が成立したマウスに致死量の肺炎球菌を経気道的に感染させ、経時的に生存率（人道的エンドポイントに従う）や菌数（BALF、肺、脳、血液など）の測定を行う。②では、蛍光標識したPspA-NPをマウスに経気道的に投与し、組織（気道、肺、脳など）中の分布を病理学的に解析する。③では、②と同様に標識PspA-NPを投与したマウスのBALF中や肺内の細胞をフローサイトメトリーにより解析するとともに、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカインやケモカイン量をELISAで測定する。以上の結果を総合して、マウスモデルにおけるPspA-NPのワクチンとしての有用性を判定する。