2017 Fiscal Year Research-status Report
新規ポータブルシーケンサーを用いた網羅的微生物叢の解析-NTM感染症の病態解明-
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17K10029
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
前田 卓哉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (20383763)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
各務 博 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (30418686)
鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 下気道細菌叢 / 非結核性抗酸菌 / ナノポア型シーケンサー / MinION |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナノポア型シーケンサー(MinION)を用い、臨床現場で実践可能な細菌叢解析のツールを構築するとともに、非結核性抗酸菌患者における下気道細菌叢を評価し、その病態の解明にせまることを目標として研究を実施してきた。初年度には、本研究計画の目的を達成するため、多角的なアプローチで解析の実現にむけた検証を実施した。まずはじめに、さまざまな病原体から、均一にゲノムDNAを抽出・精製する段階での障壁である。MinIONシーケンスを実現するには、高いゲノム精製が必要であり、グラム陽性菌で困難を生じた。そのため、特に菌破砕が困難であったストレプトコッカス属について、MinIONを用いた菌種同定を目標とした小テーマを構築し、シーケンス前処理方法と近縁種同定の解析パイプラインを構築した（論文作成中）。次に、細菌叢解析方法の予備的検証である。病原体の全ゲノムを直接的にシーケンスする方法と、PCR法による増幅産物をシーケンスする方法について、それぞれにおけるMinIONでのシーケンスと、得られるシーケンスデータ解析のパイプラインを研究室で構築する小テーマを立ち上げた。ここでは、下気道検体ではきわめて微量な菌量を取り扱うことから、まずは敗血症患者から得られた陽性血液培養ボトル内での細菌叢解析をそれぞれの方法で実施し、その実験方法とコンピュータ解析方法を確立した（論文作成中）。下気道細菌叢の解析には、以上の知見をもとにMinIONを用いた解析方法を構築していく計画である。現在、下気道検体(BALF洗浄液)の収集を開始したほか、次世代型シーケンサーを用いた従来型の手法を用い、それら検体に含まれる細菌叢の解析を開始した。この成果をレファレンスとし、MinIONを用いた細菌叢解析方法を至適化し、実際の患者検体を用いた解析へと発展させる計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、ナノポア型シーケンサーを用いた網羅的な細菌・真菌のゲノム解析の技術的構築が大前提となる。2017年には、概ねバイオインフォマティックス解析のパイプラインの構築を完了した。さらに、さまざまな病原体について、比較的解析が容易なヒト由来検体（血液培養検体）を用いた細菌叢解析まで完了した。これらの成果は、2018年前期に学術論文への投稿が可能な段階に到達できた。さらに、必要な非結核性抗酸菌患者由来の下気道検体(BALF)を継続的に収集する体制を構築することができ、Miseqを用いた事前の検証実験に着手している。以上の進捗から、計画はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度以降は、実際の患者検体の解析と、臨床情報の収集を積み重ね、MinIONによる細菌叢解析の実用性を検証するとともに、非結核性抗酸菌症における病態解析にせまる。具体的には、下気道局所における細菌叢、培養困難菌を含む複数の非結核性抗酸菌やウイルスの混合感染が及ぼす影響、など、特に病態との関連性について明らかにする。また、本技術は下気道感染症の迅速新技術にもなりうるため、診断のための検査ツールとしての有効性についても検証する計画である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額2,286円が発生したのは、キャンペーン価格などでわずかな割引などがあったためで、概ね計画通り執行していると考えます。来年度も計画通りに研究を行ってまいります。
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