2019 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive analysis of the microflora using a novel portable sequencer MinION
| Project/Area Number |
17K10029
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
前田 卓哉 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (20383763)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
各務 博 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (30418686)
鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | MinION / ナノポアシーケンサー / 非結核性抗酸菌 / 核酸精製 / ストレプトコッカス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前年度の研究を継続し、High-molecular weight-DNA抽出・精製法についての検証を継続した。とりわけ、下気道検体の微生物叢解析を正確に実行するためには、抗酸菌のほか、さまざまなグラム陰性・陽性菌や真菌による微生物叢から、菌叢比率を維持したDNA抽出が必須である。しかしながら、抗酸菌およびグラム陽性菌ではその細胞壁の確実な破壊が困難であり、MinIONシーケンスに必要な核酸純度の確保は、これまで報告される方法では実現できなかった。さらに、共存する血液など、MinIONシーケンスの精度に影響する多くの夾雑物について、いかに効果的に除去できるかが課題であった。以上のことから、より正確な気管支肺胞洗浄液の微生物叢解析の実現のためには、病原体の性状ごとに最適なDNAの抽出方法を明らかにし、最終的な検体処理方法の確立を目指し、研究を推進した。
１）ストレプトコッカス属を中心としたグラム陽性菌・・・特に肺炎球菌とmitis属ストレプトコッカスの分類は臨床的意義が高いものの、効果的なナノポア・シーケンスが非常に困難であった。本研究では、Mutanolysin(ムタノリシン)処理により効果的にDNA抽出を実現し、MinIONを用いた正確な菌種同定法を確立し、その成果を国際学術雑誌において報告した。
２）抗酸菌・・・本研究により有効な核酸抽出法を確立させ、正確な菌種同定法を確立するとともに、薬剤耐性遺伝子の検出も同時にでるパイプラインを構築し、その成果を国際学会において公表した。現在、海外学術雑誌への投稿を進めている。
３）血液混入検体の処理方法・・・血液培養ボトルにて陽性となった検体を使用した解析手法を確立した。本方法では、核酸抽出後に定量的なボトル内の起因菌を網羅的に同定するとともに、薬剤耐性遺伝子も同時に検出することを実現した。本研究成果を国際学術雑誌に報告した。
|
