2018 Fiscal Year Research-status Report
ライソゾーム逸脱型BCG-Tokyo新規ワクチン開発と免疫学的評価
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17K10035
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
本多 三男 日本大学, 医学部, 研究員 (20117378)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
相澤 志保子 日本大学, 医学部, 准教授 (30513858)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 結核 / BCG / 抗酸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度作成した組換えBCGの解析を行った。すなわち、昨年度作成した既存のBCGにMycobacterium bovisのAnigen 85B （Ag85）を組み込んだrBCG-Mbov85Bと、これまでに我々が新たに作成したrBCG-Mkan85Bの比較を行い、どちらがより有効なワクチンとなりうるか検討した。rBCG85B-Mkan85Bは既存のBCGにMycobacterium kansasiiのAg85Bを組み込んだものである。まず、組み込んだ遺伝子のシークエンスを解析し、どちらもそれぞれの抗酸菌由来のAg85B遺伝子が組み込まれていることを確認した。次に、タンパク発現をウェスタンブロットで解析した。その結果、rBCG-Mbov85BはBCGに比較して、1.8倍程度の発現量であったのに対し、rBCG-Mkan85Bは9倍程度の発現量を示した。in vivoでの免疫誘導能を解析するために、マウスにrBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bをそれぞれ接種した。免疫したマウスの脾臓細胞を採取し、エピトープペプチドでin vitroで刺激し、種々のサイトカインを産生する細胞をフローサイトメトリーで検出した。その結果、rBCG-Mkan85Bを接種したマウスの方がrBCG-Mbov85Bを接種したマウスよりも、抗原特異的に複数のサイトカインを同時に産生するpolyfunctional CD4陽性ヘルパーT細胞が多く検出された。次にCD8陽性細胞傷害性T細胞の誘導を促すために、rBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bを接種したマウスに、それぞれ対応するDNAワクチン (DNA-Mkan85BもしくはDNA-Mbov85B) を追加接種して免疫誘導能を検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本申請の研究の最終的な目的はライソゾームエスケープタイプの組換えBCGの作成と、その抗原特異的免疫誘導能の検討をすることであるが、その前段階の組換えBCGの作成に時間がかかってしまった。その理由として、BCGは遅発育菌であるため、組換えBCGを作成し、実験に必要な量まで増やすのに、時間がかかることが挙げられる。また、ワクチンのスケジュールも追加接種まで含めるとトータルで10週間かかるスケジュールで至適化されたため、1クールの動物実験を終了させるのに約3ヶ月かかるため実験の進行がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度はまず、rBCG-Mkan85BとrBCG-Mbov85Bの結核感染防御能の比較をマウスを用いて行う。具体的にはrBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bをマウスに接種し、それぞれに対応するDNAワクチン (DNA-Mkan85BもしくはDNA-Mbov85B) を追加接種する。これらのマウスに結核菌を噴霧感染させ、一定期間後に解剖する。肺や脾臓などの組織内の生菌数を検出し、比較する。
また、ライソゾームエスケープタイプのBCGの作成にも着手する。ライソゾームエスケープタイプのBCGが作成できたら、さらにM.kansasii由来のantigen 85B (Ag85B)を組み込み、新たな組換えBCGを作成する。
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| Causes of Carryover |
当初は複数回の動物実験を予定していたが、組換えBCGの作成とその発現タンパクなどの解析の実験に想定以上の時間がかかり、動物実験を1回しか施行できなかった。そのため、マウス購入費や飼育代、解析に必要な試薬を購入する予定だった費用が残った。現在、年度末から次年度にかけて2回目の動物実験を遂行中であるため、次年度使用額は動物実験とその解析に必要な試薬（抗体、フローサイトメトリー試薬など）やチューブ、プレートなどに使用する予定である。
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