Characterization of Aspergillus derived extracellular vesicles and application to a diagnostics

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K10040
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 宮崎 義継 国立感染症研究所, 真菌部, 部長 (00311861)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山越 智 国立感染症研究所, 真菌部, 室長 (00212283)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 分泌小胞 / RNA / 膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究は侵襲性アスペルギルス症の主要な原因菌であるAspergillus fumigatus（A.fumigatus）も他の真菌と同様に分泌小胞を放出することを確認し、それが感染時血中あるいは尿中に放出されることを予想し、診断に応用することを目的とした。そのために分泌小胞に含まれるRNA・タンパク質を解析し、抗膜タンパク質抗体を用いて分泌小胞を濃縮し、分泌小胞RNAを検出する系の構築を試みた。
１．分泌小胞の検出と調整法の検討：複数の培地、培養条件を検討した。培養上清から超遠心法により分泌小胞を分離した。電子顕微鏡で数十nmから１μmを超える大きさの異なる小胞を検出した。
２．分泌小胞に含まれるタンパク質の解析：SDS電気泳動法にて分泌小胞に含まれるタンパク質を分離し、銀染色で検出した。100kDa以下のタンパク質が少なくとも十数種類含まれることが明らかとなった。同定を進める過程で、他のグループによりA.fumigatusの分泌小胞に含まれるタンパク質の網羅的解析結果が報告されたので、その中から、発現量の多い細胞膜タンパク質を選択し、ポリクローナル抗体を作成した。
３．分泌小胞に含まれるRNAの網羅的解析：分泌小胞からRNAを抽出し、RNAシークエンスによりsmall RNA画分とlarge RNA画分を解析した。small RNAでは、登録されている各種RNAに加えて、これまで報告のないsmall RNAも多数検出した。large RNAでは、mRNAも検出されたが、rRNAが非常に多いのが特徴的であった。超遠心法によって得られた分泌小胞を、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、RT-PCR法で分泌小胞中のRNAを検出できた。
以上のように、分泌小胞中のRNAを検出する系を構築できたが、分泌小胞を濃縮する系の構築は今後の課題となった。

Research Products

• [Journal Article] Selection of Oral Antifungals for Initial Maintenance Therapy in Chronic Pulmonary Aspergillosis: A Longitudinal Analysis. (2020)
  • Author(s): Masato Tashiro,Takahiro Takazono,Tomomi Saijo,Kazuko Yamamoto,Yoshifumi Imamura,Taiga Miyazaki,Hiroshi Kakeya,Tsunehiro Ando,Kenji Ogawa,Kazuma Kishi,Issei Tokimatsu,Yuta Hayashi,Satoru Fujiuchi,Katsunori Yanagihara,Yoshitsugu Miyazaki,Kiyoshi Ichihara,Hiroshi Mukae,Shigeru Kohno,Koichi Izumikawa]
  • Journal Title: Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America Volume: 70 Pages: 835~842
  • DOI: 10.1093/cid/ciz287
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Echinocandins versus non-echinocandins for empirical antifungal therapy in patients with hematological disease with febrile neutropenia: A systematic review and meta-analysis. (2020)
  • Author(s): Chizuru Yamashita,Yoshio Takesue,Kazuaki Matsumoto,Kazuhiro Ikegame,Yuki Enoki,Motoi Uchino,Taiga Miyazaki,Koichi Izumikawa,Tohru Takada,Keiji Okinaka,Takashi Ueda,Yoshitsugu Miyazaki,Toshihiko Mayumi]
  • Journal Title: Journal of infection and chemotherapy : official journal of the Japan Society of Chemotherapy Volume: 26 Pages: 596~603
  • DOI: 10.1016/j.jiac.2020.01.015
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chronic Nodular Pulmonary Aspergillosis in a Patient with Rheumatoid Arthritis. (2019)
  • Author(s): Yuhei Ito,Motoaki Tanigawa,Tamiko Takemura,Keisuke Iwamoto,Akina Nigi,Hajime Sasano,Hidetoshi Itani,Shigeto Kondo,Toshiya Tokui,Shigeki Nakamura,Yoshitsugu Miyazaki]
  • Journal Title: Internal medicine (Tokyo, Japan) Volume: 58 Pages: 979~984
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.1918-18
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of a Novel Variant Form of Aspergillus fumigatus CalC and Generation of Anti-CalC Monoclonal Antibodies. (2019)
  • Author(s): Shogo Takatsuka,Tatsuya Inukai,Shun Kawakubo,Takashi Umeyama,Masahiro Abe,Keigo Ueno,Yasutaka Hoshino,Yuki Kinjo,Yoshitsugu Miyazaki,Satoshi Yamagoe]
  • Journal Title: Medical mycology journal Volume: 60 Pages: 11~16
  • DOI: 10.3314/mmj.18-00013
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Disseminated histoplasmosis from a calcified lung nodule after long-term corticosteroid therapy in an elderly Japanese patient: A case report. (2019)
  • Author(s): Keigo Kobayashi,Takanori Asakura,Ichiro Kawada,Hanako Hasegawa,Shotaro Chubachi,Kentaro Ohara,Junko Kuramoto,Hiroaki Sugiura,Seitaro Fujishima,Satoshi Iwata,Takashi Umeyama,Harutaka Katano,Yoshifumi Uwamino,Yoshitsugu Miyazaki,Katsuhiko Kamei,Naoki Hasegawa,Tomoko Betsuyaku]
  • Journal Title: Medicine Volume: 98 Pages: e15264
  • DOI: 10.1097/MD.0000000000015264
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Gastric mucormycosis complicated by a gastropleural fistula: A case report and review of the literature. (2019)
  • Author(s): Tomohisa Uchida,Momoko Okamoto,Keita Fujikawa,Daisuke Yoshikawa,Akinari Mizokami,Tomo Mihara,Akira Kondo,Kazuo Ohba,Kazuhiro Kurohama,Masahiro Nakashima,Ichiro Sekine,Shigeki Nakamura,Yoshitsugu Miyazaki,Atsushi Kawakami]
  • Journal Title: Medicine Volume: 98 Pages: e18142
  • DOI: 10.1097/MD.0000000000018142
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The incidence of endophthalmitis or macular involvement and the necessity of a routine ophthalmic examination in patients with candidemia. (2019)
  • Author(s): Ueda T,Takesue Y,Tokimatsu I,Miyazaki T,Nakada-Motokawa N,Nagao M,Nakajima K,Mikamo H,Yamagishi Y,Kasahara K,Yoshihara S,Ukimura A,Yoshida K,Yoshinaga N,Izumi M,Kakeya H,Yamada K,Kawamura H,Endou K,Yamanaka K,Yoshioka M,Amino K,Ikeuchi H,Uchino M,Miyazaki Y]
  • Journal Title: PloS one Volume: 14 Pages: e0216956
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0216956
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A dendritic cell-based systemic vaccine induces long-lived lung-resident memory Th17 cells and ameliorates pulmonary mycosis. (2019)
  • Author(s): [Ueno K,Urai M,Sadamoto S,Shinozaki M,Takatsuka S,Abe M,Otani Y,Yanagihara N,Shimizu K,Iwakura Y,Shibuya K,Miyazaki Y,Kinjo Y]
  • Journal Title: Mucosal immunology Volume: 12 Pages: 265~276
  • DOI: 10.1038/s41385-018-0094-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 2016～2018年3年間実施したBiosafety level 3対応が必要な真菌検査について (2020)
  • Author(s): 壇辻百合香、星野泰隆、名木 稔、阿部雅弘、上野圭吾、中山靖子、橋本ゆき、東 祥嗣、犬飼達也、高塚翔吾、梅山 隆、山越 智、宮﨑義継
  • Organizer: 第31回日本臨床微生物学会総会・学術集会
• [Presentation] CRISPR / Cas9 genome editing technology to verify the contribution of known mutations in the cyp51A gene and its promoter to azole resistance in Aspergillus fumigatus. (2020)
  • Author(s): Takashi Umeyama, Tatsuya Inukai, Madoka Tateno, Satoshi Yamagoe, Shogo Takatsuka, Yasutaka Hoshino, Keiko Ishino, Yoshitsugu Miyazaki
  • Organizer: 9th Advanecs Against Aspergillosis and Mucormycosis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Hmg1 mutation conferring multi-azole resistance in Aspergillus fumigatus (2020)
  • Author(s): Teppei Arai, Takashi Umeyama, Tatsuya Inukai, Akira Watanabe, Yoshitsugu Miyazaki, Katsuhiko Kamei
  • Organizer: 9th Advanecs Against Aspergillosis and Mucormycosis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 注意すべき糸状菌 (2020)
  • Author(s): 壇辻百合香、星野泰隆、名木稔、阿部雅広、上野圭吾、中山靖子、橋本ゆき、東祥嗣、犬飼達也、高塚翔吾、梅山隆、山越智、宮崎義継
  • Organizer: 第31回 日本臨床微生物学会総会・学術集会
• [Presentation] Aspergillus fumigatusの血清存在下での増殖機構 (2020)
  • Author(s): 犬飼達也、梅山 隆、山越 智、宮崎義継
  • Organizer: 第93回日本細菌学会総会
• [Presentation] クリプトコックス症に対する新規経鼻ワクチンの開発とその作用機構: 免疫賦活性に優れたワクチン株の作製 (2020)
  • Author(s): 上野 圭吾, 柳原 尚, 清水 公徳, 山越 智, 宮﨑 義継
  • Organizer: 第93回 日本細菌学会総会
• [Presentation] Aspergillus fumigatusの細胞外小胞の解析 (2019)
  • Author(s): 山越 智、犬飼達也、高塚翔吾、星野泰隆、岡本圭祐、上野圭吾、梅山 隆、宮﨑義継
  • Organizer: 第13回アスペルギルス研究会
• [Presentation] Aspergillus fumigatusアゾール耐性株にみられるCyp51A SNPSのゲノム編集による直接検証 (2019)
  • Author(s): 梅山 隆、犬飼達也、山越 智、髙塚翔吾、星野泰隆、宮﨑義継
  • Organizer: 第63回日本医真菌学会総会・学術集会
• [Presentation] Aspergillus fumigatus B11b破壊株の増殖を抑制する血清中の成分の同定 (2019)
  • Author(s): 犬飼達也、星野泰隆、浦井 誠、梅山 隆、高塚翔吾、山越 智、東 祥嗣、阿部雅広、名木 稔、中村茂樹、宮崎義継
  • Organizer: 第63回日本医真菌学会総会・学術集会
• [Presentation] インフルエンザ続発性肺アスペルギルス症モデルの確立と重症化メカニズムに関する研究 (2019)
  • Author(s): 高塚翔吾, 林崎浩史, 犬飼達也, 山越智, 梅山隆, 星野泰隆, 上野圭吾, 宮崎義継
  • Organizer: 第63回日本医真菌学会総会・学術集会
• [Presentation] Genome editing technology to elucidate the antifungal resistance mechanisms in filamentous fungi (2019)
  • Author(s): Takashi Umeyama, Tatsuya Inukai, Madoka Tateno, Satoshi Yamagoe, Shogo Takatsuka, Yasutaka Hoshino, Yoshitsugu Miyazaki
  • Organizer: The Asia Pacific Society for Medical Mycology Congress 2019
  • Int'l Joint Research