2019 Fiscal Year Research-status Report

高病原性H5N1のシアル酸非依存的感染経路における新規受容体の同定

Research Project

Project/Area Number	17K10043
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	梶原直樹公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (70453917)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	芝崎太公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, プロジェクトリーダー (90300954) 大保木啓介公益財団法人東京都医学総合研究所, 病院等連携研究センター, 副参事研究員 (80415108) [Withdrawn]
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	インフルエンザ / 感染 / H5N1 / ヘマグルチニン / シアル酸 / 高病原性
Outline of Annual Research Achievements	H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスがシアル酸欠損細胞に感染できることをこれまでの研究で見出した。その分子機構を明らかにするため、前年度に引き続き、細胞膜上の新規受容体の探索・同定を行った。ヒトハプロイド細胞（HAP1）を用いたハプロイドジェネティックスクリーニングにより、ランダムに遺伝子が破壊された細胞集団を作製し、セルソーターなどを用いて侵入能の減弱した細胞群を濃縮した。Whole genome sequence解析によりジーントラップ遺伝子の挿入位置の特定を試みたが、ゲノムDNA上に挿入遺伝子がほとんど検出されず、受容体候補分子を選別することはできなかった。Addgene社よりジーントラップ用のベクターを新たに入手し、再度ハプロイドジェネティックスクリーニングを行い、特定の細胞集団を濃縮した。シアル酸非依存的な感染経路における新規受容体の同定は本研究の最重要課題であるため、今年度新たに調製したゲノムDNAをサンプルとしてRACE法などによるジーントラップ遺伝子の挿入位置の探索を進めている。受容体候補分子については、ノックアウトまたは過剰発現細胞を作製し、機能的な検証を実施する。また当該年度は、前年度に引き続き、H5N1亜型の鳥インフルエンザウイルス及びその変異型ウイルスを保存した。H5N1亜型の鳥インフルエンザウイルスを処置した細胞を可溶化し、抗ヘマグルチニン（HA）抗体および磁性ビーズを用いた免疫沈降実験によって、HAと相互作用する細胞膜タンパク質の探索を次年度に計画している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのシアル酸非依存的な感染経路の分子機構を解明すべく、前年度に引き続きHaploid genetic screeningによる新規受容体の同定に取り組んだ。しかしながら、新規受容体候補分子の同定には至らず、さらなる探索が必要となった。今年度に計画していたシアル酸非依存的な感染時の宿主応答を解析することができなかったため、「やや遅れている」と評価した。
Strategy for Future Research Activity	今年度新たに入手したジーントラップベクターを用いたHaploid genetic screeningにより、受容体の候補を抽出する。抽出した受容体候補分子のノックアウトまたは過剰発現細胞を作製し、機能的検証を行うことで、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのシアル酸非依存的な感染における新規受容体を同定する。また、免疫沈降実験により、HAタンパク質と相互作用する細胞膜分子の選別を行う。
Causes of Carryover	現在までの進捗状況に記載した通り、細胞膜上の新規受容体の同定が難航しており、本年度に予定していた実験及び解析を計画通り実施できなかったため、次年度使用額が生じた。発生した次年度使用額については、主に交付申請書に記載の通りであり、未解決の研究課題のために使用する予定である。具体的には、分子生物学実験試薬、細胞培養試薬、抗体等の一般試薬などの物品費、学会参加や出張のための旅費、論文投稿掲載料として使用する。