ナトリウムチャネルNav1.9遺伝子改変マウスを用いた痛みモニターの研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10047
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 野口 篤子 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (70400497)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 勉 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (20270845) ; 尾野 恭一 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (70185635)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 小児四肢疼痛発作症 / Nav1.9 / SCN11A / 遺伝子改変マウス

Outline of Annual Research Achievements

昨年の実施通り、CRISPR/Cas9法により作成した、Scn11a R222S knock in系統(Scn11aR222S/WT)の雄マウスから採取した精子とC57BL/6系統の雌マウス（3匹）の卵管膨大部より採取した未受精卵とを使用し体外受精を行ったのち、仮親（ＩＣＲ系統の雌マウス）マウスに、二細胞期胚を移植した。その後出生したマウスの遺伝子型を確認するためTaqMan Genotyping Master Mix・Custom TaqMan SNP Genotyping Assaysを用いてマウスのgenotypingを行い、knock in マウスの選別を行った。
6-8週齢の正常マウス及び、上記方法にて作成したNav1.9(p.R222S)遺伝子改変マウスの行動観察を行った。行動量の評価手法として、今年度は動物実験用運動量計測装置「nano tag」を導入した。各マウスの背部皮下組織内に、運動量モニタリングのためのチップを埋め込み、行動量のデータを蓄積した。チップ内データをPCにて読み出し、24時間の観察期間の行動量を比較した。
気圧変動の評価において、通常大気圧での評価の後、+0.1気圧および-0.1気圧下での行動量について24時間観察した。夜間活動時間の活動量を数値化したところ、通常大気圧下での活動量に差はなかったが（変異マウスvs 正常マウス、7760vs 8242）、+0.1気圧下では活動開始１時間の観察において両者ともに活動量の減少をみとめた(変異マウスで57%減、正常マウスで54%減)。さらに-0.1気圧の環境下では夜間活動の最初の１時間の観察で変異マウスでは83%の活動量の減少を、正常マウスでは75%の減少があり、低気圧下での両者には有意差が観察された。その後さらに観察を続けたところ、時間経過とともに両群の差異は小さくなり、有意差はみられなくなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

運動量測定装置nano tagの導入により、前年度に比べ行動量の客観的な計測が可能になった。しかしその一方でマウスの個体差が大きく、行動を規定する要因が多様であるために、単一の刺激による疼痛行動テストとは異なって一様の結果が得られていない。実際の疼痛発作と遺伝子変異の関係性を評価するには難しい可能性が浮上している。

Strategy for Future Research Activity

行動変化の評価方法について再検討する。24時間の通常観察では差異が確認できない可能性が高いことから、短時間の疼痛行動テスト（Von Frey test, etc）に切り替え、その実施条件に温度変化や気圧変化を加えることを考慮する。

Causes of Carryover

端数の少額であるため、2019年度分と合わせて、人工遺伝子合成等に使用予定である。