2018 Fiscal Year Research-status Report

ムコ多糖症発症における小胞体機能の役割解明と治療戦略への応用

Research Project

Project/Area Number	17K10052
Research Institution	Asahikawa Medical College
Principal Investigator	金本聡自旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90611913)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ムコ多糖症 / ライソゾーム病 / 小胞体 / 小胞体関連分解 / イズロン酸-2-スルファターゼ
Outline of Annual Research Achievements	ムコ多糖症はライソゾーム病の一種として知られ、ムコ多糖を分解するライソゾーム酵素が欠損あるいは機能低下することで全身にムコ多糖が蓄積することで発症する。本研究課題では、日本を含む東アジアにおいて発症事例の多いⅡ型ムコ多糖症（ハンター症候群）について研究を行った。ハンター症候群の原因遺伝子はイズロン酸-2-スルファターゼをコードする遺伝子であることが分かっており、これまでに多数の変異遺伝子型が既に同定されている。イズロン酸-2-スルファターゼは、生合成の際に小胞体にて翻訳後修飾を受け、ゴルジ体を経由してライソゾームへ運搬されると考えられている。ハンター症候群の発症要因の一つとして、変異型イズロン酸-2-スルファターゼの発現が小胞体機能不全を引き起こし、そのために変異型酵素が分解されることで酵素の欠損もしくは機能低下を招き、発症するのではないかと仮説を立て、その検証を行った。平成30年度は野生型および変異型イズロン酸-2-スルファターゼのタンパク質安定性を解析した。変異型タンパク質は翻訳後、前駆体のまま速やかに分解を受け、成熟型はほとんど産生されないことが分かった。また、変異型はプロテアソーム系によって分解を受けていることを明らかにした。さらに、変異型イズロン酸-2-スルファターゼはE3ユビキチンリガーゼであるHRD1を介してプロテアソーム系で分解を受けていることが分かった。変異型イズロン酸-2-スルファターゼの酵素活性は野生型に比べるとほとんど活性を持たないが、HRD1をノックダウンすると変異型の酵素活性が有意に増加することが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成30年度ではイズロン酸-2-スルファターゼの生化学的解析としてタンパク質安定性の検討と野生型および変異型タンパク質の酵素活性を調べた。タンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミドを用いて翻訳後の総タンパク質量を経時的に追跡していくチェイスアッセイを行い、ウェスタンブロッティング法で評価した。野生型イズロン酸-2-スルファターゼは前駆体型である70kDaサイズのバンドは経時的に減弱するが、成熟型である50kDaサイズのバンドは増加し、安定して存在することが分かった。一方、変異型イズロン酸-2-スルファターゼは前駆体型70kDaサイズのバンドは速やかに分解され、かつ成熟型である50kDaサイズのバンドはほとんど検出されなかった。さらに、シクロヘキシミドと同時にプロテアソーム阻害剤MG132と同時に処理してタンパク質安定性の検討をしたところ、変異型の前駆体の分解が有意に抑制された。このことから、変異型イズロン酸-2-スルファターゼはプロテアソーム系により分解されることが示唆された。プロテアソーム系で分解される可能性が高いので、分解に関与するE3リガーゼを同定するために、各種E3リガーゼをノックダウンして変異型イズロン酸-2-スルファターゼタンパク質の総量をウェスタンブロッティング法で評価した。その結果、E3リガーゼHRD1をノックダウンしたときのみ変異型イズロン酸-2-スルファターゼの分解が抑制された。野生型および変異型イズロン酸-2-スルファターゼの酵素活性について解析した。複数の変異型の酵素活性を測定したが、いずれも野生型の酵素活性に比べて3-4％程度の酵素活性しか有していなかった。しかしながら、変異型を発現する細胞においてHRD1をノックダウンすると、変異型イズロン酸-2-スルファターゼの酵素活性は、HRD1をノックダウンしない細胞に比べて有意に増加することが分かった。
Strategy for Future Research Activity	イズロン酸-2-スルファターゼをプロセシングする分子の同定を試みる。平成30年度ではイズロン酸-2-スルファターゼに対する免疫沈降を行い免疫沈降サンプルを精製し、質量分析を進めたが、同定に至らなかった。タンパク質分解阻害剤や架橋剤等を用いて、プロセシング分子が保たれる最適条件を検討し、再度質量分析を試みる。ハンター症候群の新たな治療薬開発の目的で薬剤スクリーニングの系を立ち上げる。変異型イズロン酸-2-スルファターゼはライソゾームへの移行が認められないので、変異型イズロン酸-2-スルファターゼをGreen Fluorescent Protein等の蛍光タンパク質標識した融合タンパク質を作成し、リアルタイムで細胞内局在を検出できる系を作出する。化合物ライブラリーを用いて、薬剤処理によって細胞内局在が変化する化合物を見出す。酵素活性に影響を与える要因の検討として、イズロン酸-2-スルファターゼの立体構造解析も行う。
Causes of Carryover	当初計画よりも試薬購入費用がかからなかったため。次年度使用額は、当該年度使用額とほぼ同額必要と考えているため、当該年度未使用分を試薬購入費として充てる予定である。