Study on the mechanism of inflammation in the CNS of gangliosidosis

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10057
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 山中 正二 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (80264604)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 章 横浜市立大学, 医学研究科, 客員講師 (20381585)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ガングリオシドーシス / 炎症 / 自然免疫 / 遺伝病 / ガングリオシド / マイクログリア

Outline of Annual Research Achievements

ライソゾーム病のひとつであるガングリオシドーシスは、中枢神経系に先天的に代謝できないガングリオシドが蓄積することにより、病態が進行すると考えられてきた。しかし、近年、自己抗体やその他何らかの原因により中枢神経系で引き起こされる炎症反応が病態の進行に深く関与していることが解明されたが、その詳細なメカニズムは未だ解明されていない。
本研究では、過剰に死細胞から放出された代謝されない糖脂質GM2, GA2がToll様受容体（TLR）を介して直接マイクログリア等を刺激することにより、中枢神経系での炎症反応を促進すると推測し、その詳細なメカニズムの解明とそのアンタゴニストを用いた治療法の開発を目的としている。
本年度はGM2ガングリオシドーシスの一つサンドホフ病のモデルマウス(以下、SDマウス)を用い、SDマウスの中枢神経系よりマイクログリアを精製分離し、蓄積物がマイクログリアを刺激し、炎症性サイトカインの産生を促すかを評価した。
GM2ガングリオシドーシスで蓄積が確認されるGM2, GA2をSDマウスの中枢神経系より精製し、別途分離したSDマウス由来のマイクログリアに添加すると、添加量依存的に炎症性サイトカイン TNF-αが産生されることが確認された。
また、GM2, GA2を添加して刺激することに際して、マイクログリアではTLR-4の発現量が増加していることが確認できた。今年度の研究で、GM2ガングリオシドーシスの一つサンドホフ病では、代謝できないGM2, GA2が炎症性サイトカインTNF-αを産生を促す刺激物質になり得ることが確認され、その刺激はマイクログリアのTLR-4を介したシグナルカスケードによるものであることを見出した

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでの研究でSDマウス由来の蓄積物が、in vitroの系でマイクログリアを刺激してTLR-4を介して炎症性サイトカインTNF-αの産生を促すことを見出した。一方、例えば培養液中に刺激物質であるGM2、GA2とTLR-4のアンタゴニスト等を添加し、炎症性サイトカインの分泌が抑制されるかなどの治療への活用の可能性を評価する研究については、完了していない。

Strategy for Future Research Activity

培養液にGM2, GA2を添加する際、TLR2, TLR4のアンタゴニスト、具体的にはTLR2に対しては抗TLR2モノクローナル抗体、TLR4に対してはLPS-RSを添加し、TNF-α、IL-1βの発現量を定量することにより、その効果を確認する。治療効果の研究として、SDマウスに尾静注により、TLR2, TLR4のアンタゴニストである抗TLR2モノクローナル抗体、LPS-RSを投与し、運動能、神経症状、寿命への効果を検証する。in vivoレベルでアンタゴニスト投与よる分子レベルでの改善効果を評価するため、中枢神経系でのTLR2, TLR4の発現量、TNF-α、IL-1βの発現量、MAPカスケード、NF-kBの活性化を定量的PCR及びウエスタンブロット法により定量、確認する。アンタゴニスト投与よる中枢神経系での組織レベルでの改善効果を評価するため、神経細胞の数や形態、プルキンエ細胞の変性状況、マイクログリアの活性化、アストロサイトの増殖程度を病理学的解析により、評価する。

Causes of Carryover

研究費が交付されると分かってからマウスを増やし始めたため、マウスのin vitroの実験のスタートが遅くなった。それゆえ、学会報告予定分相当の金額が次年度使用に回る形となった。次年度は「今後の推進方策」とおりに研究をし、学会報告をする予定である。

Research Products

• [Journal Article] FcRγ-dependent immune activation initiates astrogliosis during the asymptomatic phase of Sandhoff disease model mice. (2017)
  • Author(s): Ogawa Y, Sano T, Irisa M, Kodama T, Saito T, Furusawa E, Kaizu K, Yanagi Y, Tsukimura T, Togawa T, Yamanaka S, Itoh K, Sakuraba H, Oishi K.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 13 Pages: 40518
  • DOI: 10.1038/srep40518
  • Peer Reviewed